【关键词】 低分子肝素 内皮抑素 修饰 角膜 新生血管 兔
its angiogenesis effects on rabbit corneas
Abstract: Objective To investigate the modification of endostatin (ES) with low molecular weight heparin (LMEH) and its inhibitory effects on corneal neovascularization（CNV）. Methods ES was modified with LMWH by a chemical method. The rabbit CNV model was made with alkali burning. LMWHES(group 1)， ES (group 2) and normal saline(control group) were subconjunctivally injected. Results The blood vessel was shorter and smaller in group 1 than in the other two groups(P<0.05) and the expression of VEGF in group 1 was also significantly lower than that of the other two groups(P<0.05). Conclusions LMWHES can effectively inhibit the growth of CNV and is superior to ES.
Key words: Low molecular weight heparin; Endostatin; Modification; Cornea; Neovascularization; Rabbit
找一种效果更佳的内皮抑素修饰物。
1 资料与方法
1.1 材料 含内皮抑素基因的重组表达载体工程菌（山东大学免疫学研究所）； LMWH（50 antFXa u/mg，中国烟台东诚生化有限公司）； 健康成年新西兰白兔30只（山东大学动物实验中心），体重2.0 2.5?kg，雌雄兼有，眼部无异常。
1.2 方法
1.2.1 LMWH对ES的化学修饰 采用毕赤酵母表达系统，按照文献［4］的方法进行内皮抑素蛋白的表达，分离纯化后得到电泳单点纯的内皮抑素。采用高碘酸氧化法活化LMWH，制得LMWH活化液，于pH 9.5、0.3?mol/L的NaCO- NaHCO3缓冲液中对内皮抑素进行化学修饰。通过SDSPAGE电泳监测修饰反应过程，比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率。测定ES及LMWHES在25?℃和37?℃水浴中的热稳定性。
1.2.2 LMWHES及ES对兔角膜碱烧伤后新生血管抑制作用的观察 30只兔用氯胺酮（25?mg/kg）及氯丙嗪（25?mg/kg）诱导全麻，将浸润1?min的1?mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔右眼角膜中央30?s，然后立即用20?ml BBS冲洗烧伤区及结膜囊1?min建立实验模型。
随机将兔分为3组，每组10只。碱烧伤后第一天，分别在球结膜下注射50?μg/ml LMWHES（Ⅰ组）、50?μg/ml内皮抑素（Ⅱ组）和生理盐水（对照组）各0.2?ml，以后隔日注射1次，共8次。每天行裂隙灯显微镜观察球结膜、角膜有无充血、水肿及全身状况。并于术后第4、7、10、13天用双脚规测量CNV长度，并用数码相机定位拍摄CNV生长状态，将其输入计算机使用软件Image Pro Plus进行图像分析。
碱烧伤后16天用空气栓塞法处死动物，无菌下取带2?mm宽巩膜的角膜组织进行病理学检查 ，进行HE染色和SP免疫组化分析。染色结果判断：细胞浆黄色为+，棕色为，棕黑色为；结果分析：采用日本产LUZEXF图像分析仪，以灰度值表示VEGF的含量。微血管数量观察：取上述免疫组化切片，每只眼选3张，每张切片任选5个高倍视野（×400），计算每个视野下CNV横断面数目。
1.3 统计学处理 计量资料以±s表示，采用方差分析检验，以P<0.05为差异有统计学意义。部分指标行相关分析，数据统计运算采用（statistic package social science,SPSS 11.5）统计软件包。
2 结 果
2.1 LMWH对ES的化学修饰 采用毕赤酵母表达系统获得的内皮抑素分子量约为20?KD，纯度达98%以上。通过SDSPAGE电泳监测修饰反应过程，比较不同时间点修饰液的自由氨基修饰率、活性保留百分率以及比较电泳监测结果确定LMWH修饰ES的时间为48?h。对分离纯化后的LMWHES进行SDSPAGE电泳鉴定，结果显示纯化后的LMWHES在30?kD左右出现一条单一条带，见彩图6。
ES和LMWHES在25?℃和37?℃时的稳定性比较及活性保留百分率（%）：37?℃时稳定性大小为LMWHES>ES，保温60?min后活性保留百分率：LMWHES（59.34%）、ES（49.91%）；25?℃时稳定性大小为LMWHES>ES，保温60?min后活性保留百分率:LMWHES（74.46%）、ES（66.78%）。
2.2 LMWHES、ES对兔角膜新生血管的抑制作用情况 Ⅰ组角膜水肿轻，CNV细小，稀疏，多集中于上角膜缘，呈缓慢性生长，血管未长入烧伤区；Ⅱ组角膜水肿不明显，CNV短、小，管径较细，生长较缓慢，血管接近烧伤区。对照组角膜水肿重，CNV粗乱，密集，生长快且范围广，第4天可见CNV向碱烧伤处生长，第10天可见CNV长入接近瞳孔区。在碱烧伤后第7天Ⅰ组、Ⅱ组、对照组的平均新生血管长度(mm)分别为1.32±0.18、1.77±0.27、2.32±0.58, 平均面积(mm2)为4.33±1.21、5.84±1.27、7.52±1.35,治疗组与对照组相比以及两治疗组间相比差异有统计学意义（P<0.05）。碱烧伤后第13天的新生血管生长情况见彩图7 9。
VEGF免疫组化结果为：对照组在角膜全基质层内有炎性细胞浸润，在炎性细胞胞浆可见VEGF表达呈；Ⅰ组在角膜前1/3基质层内有炎性细胞浸润，在炎性细胞胞浆可见VEGF表达呈＋ ；Ⅱ组在角膜前1/2基质层内有炎性细胞浸润，在炎性细胞胞浆可见VEGF表达。图像分析显示Ⅰ组、Ⅱ组与对照组VEGF含量（灰度值）依次为102.35±18.56、125.46±21.43、152.05±25.24，治疗组与对照组相比及两治疗组间相比VEGF表达均明显减少（P<0.05）。
新生血管形态和数量观察的结果：对照组在角膜全基质层内可见大量成熟的新生血管，管壁薄、管腔大、排列紊乱；Ⅰ组浅基质层内可见少量新生毛细血管，管腔较小，分布稀；Ⅱ组新生血管介于两者之间。Ⅰ组、Ⅱ组、对照组的新生血管数量（个/400倍视野）分别为1.05±0.84、3.56±1.85、6.22±2.79，治疗组与对照组相比及两治疗组间相比差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨 论
ES是1997年于小鼠血管内皮细胞瘤的培养上清中发现的，后证实是由体内XVIII型胶原在组织蛋白酶或金属蛋白酶作用下，其羧基末段被分解出的一段大小为20?kD的片段［1］。ES是目前公认的最强的新生血管抑制剂，可以特异性作用于血管内皮细胞，抑制其增殖和移行，从而抑制新生血管生长。
近年来多肽、蛋白质作为药物，已越来越多地应用于临床。但是蛋白质具有抗原性，且有的蛋白质由于在体内半衰期短、生物利用度低而达不到治疗作用。化学修饰能够赋予蛋白质和多肽类药物许多优良性能，如免疫原性降低或消失，毒副作用减少，半衰期延长，物理、化学和生物稳定性增强等。基于内皮抑素的作用机制及肝素的生物学特性，内皮抑素既对内皮细胞有亲和作用又具有肝素的特异性结合位点［5］，故本研究采用LMWH对ES进行结构修饰。
我们利用LMWH成功的对内皮抑素进行了化学修饰，获得了理想的内皮抑素修饰物，其在25?℃和37?℃时的稳定性及活性保留百分率明显优于内皮抑素，表明低分子肝素化后的内皮抑素稳定性得到增强，在不明显影响其活性的前提下，其最佳修饰反应的时间为48?h。
角膜CNV是由角膜缘血管网形成的新生毛细血管逐渐侵入角膜而形成，与血管内皮细胞的增殖密切相关［6］。本实验采用碱烧伤法诱导角膜新生血管的形成［7］，该模型非常逼真地再现了角膜碱烧伤的病理状态，是研究炎症性新生血管发生机制和治疗的重要手段，且此模型操作简便，便于观察和比较新生血管生长状况。
将LMWHES用于治疗碱烧伤诱导的角膜新生血管，结果表明它可明显抑制CNV的增生，主要表现为CNV生长速度减慢，生长面积较少，与内皮抑素组及生理盐水对照组相比，有统计学差异（P<0.05）。组织病理学结果显示LMWHES组只在浅基质层内见少量新生毛细血管、管腔较小、分布稀疏，与内皮抑素组及对照组比较新生血管数量明显减少，VEGF的表达也明显低于上述二组。
本研究表明，内皮抑素经过低分子肝素修饰后，热稳定性增强，抑制兔眼角膜新生血管的作用优于内皮抑素。
【参考文献】
［1］ 〖ZK(#]O′reilly M S, Boehm T, Folkman J, et al. Endostatin:an endogenous inhibitor of angiognesis and tumor growth［J］. Cell, 1997, 88（2）:277285.
［2］ Robert B M,George K A. Serotonergic facilitation of facial motoneuron excitation［J］. Brain Res, 1979, 169:1127.
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［4］ 王晓燕，孙汶生，马春红，等. 重组人分泌型endostatin的纯化及其抑癌活性探讨［J］.中国肿瘤临床，2003,30（2）：136139.
［5］ Kreuger J, Matsumoto T, Vanwildemeersch M, et al. Role of heparan sulfate domain organization in endostatin inhibition of endothelial cell function［J］. EMBO J, 2002, 21(23):63036311.
［6］ Chang J H, Gabison E E, Kato T, et al. Corneal neovascurization［J］. Curr Opin Ophthalmol， 2001,12（4）:242249.
［7］ 邱培瑾.角膜新生血管的动物模型［J］.国外医学眼科学分册，2000, 24: 360363. |
