作者：阳菊华, 童绎, 朱益华, 肖继勇, 陈贻锴, 林建银

　　关键词: 角膜营养不良,遗传性; 基因; 突变; 序列分析,DNA; 聚合酶链反应; 系谱
          
　　ABSTRACT: Objective Molecular genetic analysis of a large Chinese corneal dystrophy kindred. Methods Thirteen individuals including seven affected and six unaffected family members in this granular corneal dystrophy kindred were studied. Genomic DNA was purified from blood peripheral leukocytes. All of the exons of both the Keratin3 and the keratin12 genes, and the exon 4 and exon 12 of BIGH3 gene were amplified using polymerase chain reaction(PCR), followed by direct bidirectional sequencing for mutation detection.  
    
　　The mutation was confirmed by restriction digest analysis. Results   Direct sequencing of the patients' genomic DNA revealed there was no mutation in all of the exons of K3 and K12 genes, but a missense mutation(CGG>TGG) in the exon12 of BIGH3(R555W) was found. This mutation in this family completely cosegregates with the disease phenotype. Conclusion  This kindred was diagnosed with granular corneal dystrophy harbored a heterozygous R555W mutation of the BIGH3 gene.

　　KEY WORDS:corneal dystrophy,hereditary; genes; mutation; polymerase chain reaction

　　基金项目: 福建省自然科学基金资助项目(C0510009),福建医科大学科学研究发展基金资助项目(FJGXY04020)

　　角膜营养不良(corneal dystrophy)是一组与遗传有关的原发性、具有病理学组织学特征的疾病。目前,已确定与角膜营养不良的致病基因有BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S2和GSN等。BIGH3基因突变至少可导致4种类型的角膜营养不良,包括颗粒状角膜营养不良(R555W)、Avellino角膜营养不良(R124H)、格子状角膜营养不良(R124C)和ThielBehnke角膜营养不良(R555Q)[1]。K3和K12基因突变导致Meesmann角膜营养不良[2]。笔者研究的家系为福建医科大学附属第一医院眼科普查时发现，先证者在裂隙灯下检测可见双角膜中央区有散在的细小圆形小泡,位于上皮层,斜照时呈散在的灰白点状,后照亮下呈透明小气泡样,临床表现为Meesmann角膜营养不良[3]。2004年,笔者随访该家系,家系图谱表现为常染色体显性遗传;在裂隙灯下检测先证者,发现不仅角膜上皮层受累,而且累及角膜实质层,临床表现为颗粒状或Avellino角膜营养不良。笔者对该家系进行分子遗传学分析,以确定其类型与致病分子机制。

　　1 对象与方法

　　1.1　对象       

　　家系3代38人,受累患者12人,获得其中7例受累患者和6例非受累正常家系成员的血样标本,10例无眼疾正常人的血样标本作为正常对照组(图1)。☆:获取血样标本的家系成员.

　　1.2 试剂和仪器      

　　PCR所用试剂、琼脂糖凝胶、溴化乙锭(EB)、BstXⅠ和DNA分子量标记等(大连宝生物公司);PCR扩增BIGH3基因外显子12的引物序列: BIGH3e12F:5’CAGCGTGGTGAGGTATTTAAGG3　BIGH3e12R:5’GTAGTAAAGGCTTCCCAGGGTT3’

　　1.3 基因组DNA提取       

　　取外周血样3 mL,置于EDTAK3抗凝的真空采血管中;按Wizard Genome DNA Purification Kit(Promega)说明书提取基因组DNA。

　　1.4 聚合酶链反应(PCR)       

　　PCR反应体系25 μL,包括10×PCR缓冲液(20 mmol/L Mg2＋plus)2.5 μL、dNTP mix(2.5 mmol/L each)1 μL、PCR上游和下游引物(10 μmol/L)各1 μL、基因组DNA(约100 ng)1 μL和TakaRa Ex TaqTM 0.25 μL、ddH2O补足25 μL;PCR反应条件为:94 ℃ 3 min→94 ℃ 30 s→55 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 3 min。

　　1.5 PCR产物直接测序      

　　2％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物特异性后,PCR产物直接送大连宝生物公司测序。

　　1.6 限制性内切酶分析       

　　BIGH3 R555W位点突变产生一个新的限制性内切酶位点,可被BstXⅠ识别(BstXⅠ识别序列为:CCANNNNN/NTGG);酶切反应体系20 μL,45 ℃ 3 h。

　　2 结果

　　2.1 K3和K12基因突变检测       

　　Meesmann角膜营养不良是由K3和K12基因突变所致,且目前发现的突变全部分布在K3和K12角蛋白高度保守区HIM(helix initiation motifs)和HTM(helix termination motif)区域[2,4]。首先筛查文献已报道的K3和K12基因突变区域,即K12基因的外显子1和外显子6以及K3基因的外显子7。DNA测序结果表明在这些区域没有突变,进一步扫描K3和K12基因整个外显子区域,也未发现突变。2004年随访,裂隙灯检测发现症状发生改变,先证者的临床表现可能为颗粒状或Avellino角膜营养不良(图2)。

　　2.2BIGH3基因突变检测       

　　PCR扩增BIGH3基因外显子4和外显子12,DNA直接测序分析,结果显示患者(先证者Ⅱ7和Ⅲ1)在BIGH3基因的外显子12发生杂合突变(CGG>TGG),即BIGH3 R555W突变(图3A);另外,在两位患者的BIGH3基因外显子12还发现一个多态位点(Phe540Phe)(图3B);内切酶BstXⅠ分析结果显示该家系的BIGH3 R555W突变与疾病表现型呈完全共分离(图3C),表明该例Meesmann角膜营养不良家系属颗粒状角膜营养不良,且为BIGH3基因R555W突变杂合子。

　　3 讨论
               
　　角膜营养不良一般依据病史和裂隙灯检测可作出初步的临床诊断,且主要按病变发生的解剖学部位将其分为前部、实质部和后部角膜营养不良三类。然而,在进行性病变过程中,角膜营养不良还表现一个共同特点,即开始先侵犯角膜的某一层,晚期可波及邻近层次,甚至影响全层角膜。因此, A:DNA测序分析突变位点; B:BIGH3单核苷酸多态性位点(T/C); C:限制性内切酶BstXⅠ分析.

　　在临床诊断分型,特别是晚期患者的诊断分型带来很大的混淆。随着角膜营养不良分子遗传学的深人研究,以致病基因的分子特征作为临床诊断和分类、分型的依据,其可靠性和准确性也得到了大大提高,并且越来越受到国内外同行们的广泛认可。
               
　　Meesmann角膜营养不良属于前部角膜营养不良,临床表现主要为角膜上皮层内散在着无数细小圆形透明囊泡,是由K3或K12基因突变所致[2]。颗粒状角膜营养不良属实质部角膜营养不良,依据角膜表征目前至少可以分为3种类型：Avellino角膜营养不良、典型颗粒状角膜营养不良和浅表变异型颗粒状角膜营养不良,分别是由于BIGH3基因的R124H、R555W和R124L突变所致[5]。目前,在世界各国的相关研究中均发现BIGH3基因的第4外显子的R124和第12外显子的R555为突变热点;与BIGH3基因R555W突变相关的颗粒状角膜营养不良患者在欧洲和美国较为常见,在日本却较为少见[1]。
               
　　分子遗传学分析结果显示,笔者研究的家系受累患者存在BIGH3 R555W突变杂合子,突变与疾病表现型呈完全共分离,而在K3和K12基因没有发现突变。因此,从基因突变分析结果可以确诊该家系不属于Meesmann角膜营养不良,而是典型的颗粒状角膜营养不良。
               
　　据报道在该家系中先证者角膜病变开始发生于上皮层[3],随后波及角膜实质部。因此,结合临床症状与基因突变分析,该家系患者又可能是BIGH3 R555W杂合突变导致的角膜上皮层与基质层先后受累的颗粒状角膜营养不良,可归于浅表变异型颗粒状角膜营养不良。

　　Escribano等研究表明角膜上皮细胞特异性高表达BIGH3基因[6];Hirano等认为BIGH3蛋白是由上皮细胞合成,内皮细胞也可能合成BIGH3蛋白[7];Okada曾报道一种由BIGH3 R555W纯合子突变导致的浅表变异颗粒状角膜营养不良[8]。这些报道间接说明BIGH3 R555W杂合突变也又可能导致浅表变异型颗粒状角膜营养不良。遗憾的是没有先证者的早期裂隙灯照片及组织病理检测来直接支持这种可能性。

　　参考文献：

　　[1]Pieramici S F,Afshari N A. Genetics of corneal dystrophies: the evolving landscape[J]. Curr Opin Ophthalmol, 2006,17(4):361366.

　　[2]Irvine A D,Corden L D,Swensson O,et al. Mutations in corneaspecific keratin K3 or K12 genes cause Meesmann's corneal dystrophy[J]. Nat Genet, 1997,16:184187.

　　[3]肖继勇,童绎. Meesmann角膜营养不良一家系[J]. 中华医学遗传学杂志, 1993,10(1):9.

　　[4]Chen Y T,Tseng S H,Chao S C. Novel mutations in the helix termination motif of Keratin 3 and Keratin 12 in 2 Taiwanese families with Meesmann corneal dystrophy[J]. Cornea, 2005,24:928932.

　　[5]Munier F L,Frueb B E,OtheninGirard P,et al. BIGH3 mutation spectrum in corneal dystrophies[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2002,43(4):949954.

　　[6]Escribano J,Hernando N,Ghosh S,et al. cDNA from human ocular ciliary epithelium homologous to beta igh3 is preferentially expressed as an extracellular protein in the corneal epithelium[J]. J Cell Physiol, 1994,160(3):511521.

　　[7] Hirano K,Klintworth G K,Zhan Q,et al. Cintron C.Beta igh3 is synthesized by corneal epithelium and perhaps endothelium in Fuchs' dystrophic corneas[J]. Curr Eye Res, 1996;15(9):965972.

　　[8]Okada M,Yamamoto S,Watanabe H,et al. Granular corneal dystrophy with homozygous mutations in the keratoepithelin gene[J]. Am J Ophthalmol, 1998,126:169176.