【摘要】 观察补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction,BYHWT）对Wistar大鼠视网膜、视神经缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并进一步探讨补阳还五汤的作用机理。
方法：使用Wistar大鼠建立视网膜、视神经缺血再灌注损伤模型。模型建立后，将大鼠随机分为2组：（1）中药组：缺血60min后开始灌服BYHWT水煎剂[10g/(kg·d)]；（2）对照组：缺血60min后开始灌服平衡盐液[10g/(kg·d)]。两组分别在灌服后24h、6wk取材行视网膜和视神经的超微结构观察。
结果：中药组24h和对照组的视网膜及视神经的超微结构均有明显病变，但中药组较对照组变化轻微。中药组6wk的视网膜及视神经的病变基本恢复正常；对照组仍存明显病变。
结论：补阳还五汤对大鼠视网膜、视神经缺血再灌注损伤具有保护作用。
【关键词】 缺血再灌注损伤 视网膜 视神经 补阳还五汤 电子显微镜
0引言
视网膜的急性、慢性缺血和视网膜循环障碍，如糖尿病性视网膜病变、视网膜血管栓塞性疾病、高眼压性疾病等，均可导致视网膜、视神经的严重损伤。这是中老年人致盲的重要原因之一[1]。一般认为治疗视网膜缺血的措施主要是恢复血流再灌注[2,3]。但是一些学者观察到，早期缺血的视网膜并未出现明显的功能障碍，而视网膜血流恢复灌注后，其功能障碍和结构损伤有时反而加重，表现为视力下降、视网膜水肿，并逐渐转化为不可逆性损伤，此即视网膜、视神经的缺血再灌注损伤(retinal ischemic reperfusion, RIR)[3]。因此如何减轻或防止视网膜、视神经缺血再灌注引起的损伤，以保护视网膜、视神经功能，具有重要的意义。本研究拟观察补阳还五汤（Buyang Huanwu Decoction,BYHWT）对Wistar大鼠视网膜、视神经缺血再灌注损伤是否具有保护作用，并进一步探讨补阳还五汤的作用机理。
1材料和方法
1.1材料
采用青岛市实验动物和动物实验中心提供的出生后3mo健康Wistar大鼠30只，体质量200～250g，雌雄不限，随机分为中药组和对照组。饲养地点：山东省眼科研究所省部共建国家重点实验室培育基地动物饲养中心。符合ARVO有关用于研究目的动物的相关规定（ARVO Resolution on the Use of Animals in Research）。补阳还五汤主要由黄芪120g、赤勺10g、当归10g、红花10g、地龙10g、川芎10g和桃仁10g等组成。由制剂室制成水煎浓缩剂，使生物药浓度为1g/mL，无菌密封后置入4℃冰箱中保存备用。
1.2方法
视网膜缺血再灌注损伤模型的建立:本实验采用急性高眼压诱导视网膜缺血再灌注损伤的方法[4]。将输液瓶升高到距大鼠150cm时可形成14.63kPa的压力,这一压力接近大鼠的体循环收缩压，故能够造成大鼠视网膜血管断流，具体如下：(1)麻醉：盐酸氯胺酮注射液腹腔注射麻醉。局部应用4g/L盐酸奥布卡因滴眼液每5min滴1次,连滴4次。(2)大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型的建立：选取Wistar大鼠右眼为实验眼，复方托品酰胺滴眼液散瞳后将连接平衡液的26号针头从耳前角巩膜缘内刺入前房，平衡液瓶高度为150cm，眼压升高后可见视网膜的红色反光转变成灰白色，60min后拔除灌注针头，恢复视网膜血供。(3)灌服中药：中药组于缺血60min后开始灌服BYHWT水煎剂，2次/d，总剂量为10g/(kg·d)，对照组灌服相同剂量的生理盐水。中药组在灌服后24h(动物数量n= 7)、 6wk(n= 7)；对照组在灌服后24h(n= 4)、6wk（n= 6），摘除眼球，行视网膜和视神经的超微结构观察。(4)透射电子显微镜观察：大鼠处死后立即摘取眼球，放入40g/L戊二醛—二甲胂缓冲液固定1h，去除内容物，取视网膜及视神经部。按照我研究所常规制作电镜标本后，半薄切片行甲苯胺蓝染色后应用光学显微镜观察，超薄切片后行醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，应用透射电子显微镜（HITACH H7000,Tokyo,Japan）对视网膜、视神经的超微结构进行观察。
2结果
2.1视网膜病理改变
光学显微镜下变化：24h对照组和中药组的视网膜均显示细胞数目明显减少，个别部位甚至消失、外节层变薄，排列不整（图1A），但中药组的病理改变程度较对照组轻微（图1B）。6wk对照组显示视网膜外颗粒层变薄、排列紊乱(图1C)，而中药组未显示出明显的病理改变（1D）。电子显微镜下变化：24h对照组和中药组的视网膜均显示外颗粒层变薄，核染色质浓缩、部分区域的外节层消失，色素上皮层与外颗粒层之间可见髓样体出现、色素上皮层可见大量空泡线粒体形成（图2）。
6wk对照组可见色素上皮层高低不均，外节层变薄、排列不整，内节层变薄、线粒体变性呈空泡状。中药组6wk视网膜的形态大致正常（图3）。
2.2视神经病理改变
光学显微镜下变化：6wk对照组显示视神经的有髓纤维数目明显减少，可见片状无髓鞘区域、排列紊乱（图4A）。而中药组视神经的有髓纤维数目无变化、排列均匀（图4B）。电子显微镜下变化：6wk对照组显示视神经的有髓纤维呈无结构样变化，纤维数量减少、层数变薄、直径大小不一，可见神经胶质细胞增生。中药组视神经的有髓纤维排列整齐、直径大小均匀、髓鞘厚度均一（图5）。
3讨论
视网膜缺血再灌注损伤是眼科领域中难于医治的顽疾之一。常见于糖尿病性视网膜病变、视网膜分支静脉阻塞、青光眼患者等，也可发生于改变视网膜血流的眼科手术后，是中老年人重要的致盲原因之一。尽管医学工作者做了许多努力，但是迄今尚无理想的治疗方法。
3.1 BYHWT对视网膜缺血再灌注损伤中视网膜超微结构的影响分析
(1)对视细胞以及内外节层的影响:本研究显示24h对照组视网膜色素上皮与外颗粒层之间的内、外节层的构造消失。视网膜色素上皮细胞内线粒体及细胞的绒毛减少。外颗粒层核染色质浓缩，细胞核层数减少。神经纤维层变薄、有空泡出现，并可见髓样体。24h中药组视网膜的色素上皮与外颗粒层之间的内、外节层的构造消失。视网膜色素上皮层内满布外节的层状结构物，可见髓样体。外颗粒层排列稀疏、高度降低至少1～3层，细胞核大小不一、有切迹、染色质浓缩。内颗粒层变薄，甚至仅一层细胞。神经纤维层高度变薄，有大量空泡。6wk对照组视网膜的色素上皮与外颗粒层之间的内、外节层消失。外颗粒层核染色质浓缩细胞核层数减少，仅3～4层。神经纤维层内血管增多，并可见有出血现象、色素上皮内外节层状结构的吞噬物和髓样体。而6wk中药组视网膜的色素上皮与外颗粒层之间的内、外节层分布均匀，外节层高度适中，排列整齐。视网膜色素上皮细胞内线粒体满布、细胞的绒毛细长。外颗粒层核染色质均匀分布，高达7～8层。（2）对视神经的影响:当眼压增高时，视神经内正向和逆向轴浆运输均被抑制，进而影响神经节细胞及神经胶质细胞的活性。电子显微镜下，6wk对照组显示视神经的有髓纤维呈无结构样变化，纤维数目减少、层数变薄、直径大小不一，并可见神经胶质细胞增生。中药6wk组则显示视神经的有髓纤维排列整齐、直径大小均匀、髓鞘厚度15～20层。
由上可以看出BYHWT对视网膜以及视神经具有明显保护作用，可减轻大鼠视网膜缺血再灌注急性期的水肿和再灌注恢复期（6wk）视网膜的变性、萎缩。对视神经的有髓纤维也具有良好的保护作用。用药时间越长，对视网膜的缺血再灌注的保护作用越明显。
3.2 BYHWT每味中药及有效化学成分抗视网膜缺血再灌注损伤的机理
视网膜缺血再灌注损伤的机制尚未完全清楚，本研究从祖国传统医学中一种常用的方剂入手，探讨其在视网膜缺血再灌注损伤中的临床应用。BYHWT在临床上多做为一种益气活血的汤剂使用，其中的每味药都具有抗视网膜缺血再灌注损伤的作用，具体描述如下：黄芪：主要有效成份为黄芪总黄酮和黄芪皂苷，大量实验研究证实其对二甲亚砜体系产生的氧自由基信号有抑制作用[12]。黄芪总黄酮可使冠脉血液中的自由基明显减少。黄芪皂苷可使再灌注损伤的心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）含量明显增高，脂质过氧化物（LPO）和氧自由基波谱信号降低，表明黄芪皂苷是氧自由基的良好清除剂[13]。另外黄芪具有抑制血小板聚集、抗血栓作用。
桃仁：主要成分为苦杏仁苷、野樱苷甾醇类。具有抗凝血和抗血栓形成作用，能明显增加股动脉的血流量并降低血管阻力[14]。川芎：主要成分为盐酸川芎嗪、黑麦草碱、蒿苯内脂。有实验证明[15]，在心肌缺血再灌注损伤模型中，川芎可提高左心室内压峰值，通过提高对氧自由基的清除及拮抗脂质过氧化反应而保护缺血再灌注损伤的心肌，并有抑制血小板聚集作用。地龙：主要成分为蚯蚓素、蚯蚓解热碱、蚯蚓毒素、黄嘌呤、胆碱等类脂化合物。地龙醇提取物给兔静注，可使血小板血栓和纤维蛋白血栓形成时间明显延长，血栓长度和干重减少，表现出明显的抑制血栓形成的作用[16]。红花：主要成分为绿原酸、咖啡酸、儿茶酚、多巴、红花甘等。红花对缺血性心脏病具有保护作用[17,18]。红花提取物及红花黄色素等均能明显的增加小鼠对常压缺氧的耐力、使冠脉流量增加，并具有抗血凝、抑制血栓形成作用。当归：主要成分是各种挥发油，如：樟脑酸、藁本内脂、菖蒲二烯、香荆芥酚。具有抑制血小板聚集及抗血栓形成[19]、抗心肌缺血缺氧的作用。赤勺：主要含有芍药苷、花青素等生物碱。具有抑制血小板聚集作用[20]。
视网膜缺血再灌注损伤的机制主要是自由基产生增多，导致过氧化物和丙二醛的积聚[2123]，后者可能诱导突变、抑制酶的活性，从而引起膜受体、膜蛋白酶和离子通道的功能障碍、线粒体ATP生成减少。并且自由基与脂质、蛋白质的反应能破坏细胞膜的动态屏障，改变细胞膜的流动性和渗透性，引起细胞内物质的释放。此外，血栓的形成使视网膜缺血再灌注出现无再流现象，加重了组织的损伤。结合上述机制，可见补阳还五汤复方中每味单药分别从不同的作用点对视网膜缺血再灌注损伤有保护作用。
补阳还五汤可明显减轻大鼠视网膜缺血再灌注恢复期（6wk）视网膜的变性、坏死，对于神经节细胞、内、外核层的细胞具有明显的保护作用。
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