【摘要】 观察转化生长因子β2（transforming growth factorβ2，TGFβ2）对体外培养牛眼晶状体上皮细胞（lens epithelial cell，LEC）结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA和蛋白表达的影响。
方法:将体外培养2～3代牛LEC分为对照组和实验组，实验组分别经1，5，10μg/L TGFβ2处理24h后，采用半定量RTPCR和Western blot技术检测CTGF mRNA以及蛋白表达的变化。
结果:与对照组相比，1μg/L TGFβ2组对牛LEC CTGF/βactin吸光度比值和CTGF/βactin灰度比值的表达无明显影响（P>0.05），5，10μg/L TGFβ2组可以明显上调RTPCR和Western blot中CTGF/βactin比值（P<0.01）。
结论:TGFβ2可促进体外培养牛LEC表达CTGF蛋白及mRNA。
【关键词】 转化生长因子 晶状体上皮细胞 结缔组织生长因 白内障
0引言
病理学研究发现白内障术后后囊混浊(posterior capsule opacification, PCO)的发生源于晶状体上皮细胞(lens epithelial cell, LEC)发生上皮间质转分化的过程[1]。近年来的研究表明，转化生长因子β(transforming growth factorβ, TGFβ)在LEC的转分化过程中发挥了核心作用[15]。但长期完全阻断TGFβ的表达和活性可能引发严重的不良反应[6]。因此，深入研究TGFβ诱导LEC发生转分化的具体机制，寻找更为精确的下游靶点是PCO防治研究工作今后的方向。有研究表明，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF )在多种细胞转分化的过程中介导了TGFβ的作用[79]。Wunderlich等[10]曾用原位杂交和RTPCR发现人白内障术后发生PCO的后囊膜有CTGF的mRNA表达，与它同时表达的还有肌成纤维细胞的表型标志α平滑肌肌动蛋白，表明CTGF可能在PCO的发生中发挥了重要作用。TGFβ2对PCO发生机制研究中人LEC常用的替代材料牛LEC CTGF表达的影响尚未见报道。我们拟观察TGFβ2对牛LEC CTGF在转录水平以及翻译水平上表达的影响，为深入研究CTGF在TGFβ介导的LECs的转分化过程中的可能作用奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
牛眼取自屠宰场，用自来水冲洗后，剪去周围结缔组织，以2000U/L庆大霉素浸泡30min，DHanks液漂洗3次，沿角膜缘后5mm处环形剪开眼球，用显微剪沿晶状体剪断悬韧带，完整娩出晶状体。晶状体娩出后，沿晶状体赤道部后2～3mm处环形剪开晶状体，显微镊将晶状体前囊膜小心撕下，细胞面朝上平铺于培养皿中。加入2.5g/L胰蛋白酶消化10～15min，消化过程中，用吸管轻微吹打，促进细胞脱落。然后加入DMEM培养液（Hyclone 公司产品，含200mL/L胎牛血清，100kU/L的青链霉素）中止消化，将混合液体吸出，转入50mL培养瓶，置于含50mL/L CO2, 37oC恒温培养箱中培养。24h后换液，待细胞长出后，每3d换液1次。以2.5g/L胰蛋白酶消化传代。
1.2方法
取2～3代牛LEC以1×106个/孔的浓度接种于6孔培养板内，24h吸出培养液，用低浓度血清培养基（含10mL/L胎牛血清）孵育10h后，DHanks液洗3次，实验组加入含TGFβ2（Peprotech公司产品）的无血清DMEM培养液（Hyclone公司产品）1mL（浓度分别为1，5，10μg/L），对照组加入不含TGFβ2的等体积无血清培养液。
1.2.1 RTPCR测定CTGF mRNA的表达
24h去除培养液后，每孔加入Trizol（Invitrogen公司产品）1mL，适当的振荡和吹打。10min后收集Trizol，加入氯仿200μL，摇匀，4oC 14000r/min离心15min。取上清0.5mL加入等体积的异丙醇沉淀总RNA，4oC 14000r/min离心10min，去上清，加入750mL/L乙醇1mL洗涤沉淀，4oC 7500r/min离心5min。去上清，加入DEPC水20μL溶解沉淀，低温保存备用。按照试剂盒上说明进行逆转录（Toyobo公司产品）：去RNA酶水8μL，RT缓冲液4μL，dNTP混合物2μL，RNA酶抑制剂1μL，Oligo（dT）20 1μL，总RNA 3μL，逆转录酶1μL一共20μL体系。放入PCR扩增仪（Biometra公司产品）后，按照30oC退火10min，42oC反应20min，99oC反应5min，4oC中止5min的体系进行逆转录制备cDNA。PCR体外扩增cDNA。牛CTGF上游引物：5’TTGTGTACACGTGATTTCAGTGGC3’；下游引物：5’ATCACTGCCTCACCTTCAGCAAAC3’， 扩增后片断长度763bp。内参照βactin上游引物：5’GAGGATCTTCATGAGGTAGTCTGTCAGGTC3’；下游引物：5’CAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCA3’，扩增后片断长度349bp。采用25μL的PCR反应体系：去离子水14μL，10mmol/LdNTP 1μL，PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，上游引物1.5μL，下游引物1.5μL，模板cDNA 2μL，Tag 酶1μL。PCR扩增条件：94oC预变性5min，94oC变性40s，57.2oC(CTGF)，54oC(βactin)退火40s，72oC延伸40s，31次循环后，72oC延伸5min。扩增产物经过20g/L的琼脂糖凝胶电泳后，于紫外线箱中观察并照相记录，分子量标记物选用天为时代公司DNA Maker II。
1.2.2 Western blotting检测BLEC合成CTGF 24h去除培养液后，将培养板置于0oC的平板上，加入50μL每孔细胞裂解液（50mmol/LTrisHCl, pH7.2, 1mmol/L EDTA, 150mmol/L NaCl, 1g/L SDS, 5g/L去氧胆酸钠，10g/L NP40，1mmol/L PMSF, 10g/L Aprotinin）冰上孵育30min，期间给予适当振荡和吹打。30min后收集细胞裂解物，于4oC以12000r/min 离心10min，取上清Bradford法测蛋白浓度。取蛋白60μg上样于75g/L聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至NC膜（Biorad公司产品）上。随后将膜于50g/L脱脂奶粉封闭液中室温封闭2h后，以1∶500抗CTGF抗体（Santa Cruz公司产品）4oC孵育过夜。用TBST（50mmol/L TrisHCl, pH7.6,150mmol/L NaCl,3g/L Tween20）洗膜3次，加1∶2000的HRP标记的二抗（博士德公司产品）室温孵育1.5h。TBST洗膜3次后，浸入增强化学发光（ECL）试剂（Pierce公司产品），暗室X线片压片曝光2min，洗片。
Western blotting和RTPCR电泳图片经光密度图像扫描仪（HP）扫描，经IMAGE Quant（Alpha Innotech 公司产品）程序对条带进行灰度以及吸光度测定。
统计学处理：所有实验均重复3次，数据用均数(标准差来表示，采用单因素方差分析，以上统计均由SPSS13.0 软件包处理(显著水平α=0.05)。
2结果
2.1TGFβ2 对牛LEC CTGF mRNA表达的影响
原代牛LEC于培养48h内贴壁生长，可见牛LEC形态如纺锤样（图1）。RTPCR产物电泳结果显示，正常对照组和实验组均在763bp和374bp处出现特异性CTGF和βactin基因条带（图2）。1μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin条带吸光度比值与对照组相比，差异无显著性意义（P>0.05），5μg/L和10μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin比值与对照组相比，差异有显著意义（P<0.01, F＝288.74,图3）。
2.2 TGFβ2对牛LEC CTGF蛋白表达的影响
SDSPAGE凝胶电泳结果显示，正常对照组和实验组均有分子质量分为38kDa和43kDa的CTGF和βactin蛋白条带（图4）。1μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin灰度比值与对照组相比无显著性差异（P>0.05），5μg/L和10μg/L TGFβ2处理组CTGF/βactin灰度比值与对照组相比，差异有显著意义（P<0.01, F＝301.59,图5）。
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