Variation of collagenase content in lacrima after cornea alkali burn in rabbit model

　　SHEN Yuan-Ping，HU Jun，ZHANG Luo

　　From the Department of Ophthalmology,Tongji Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430030，Hubei Province,China

　　Abstract　Objective　To observe the relationship between morphological mutation of rabbit cornea after cornea alkali burn and the variation of collagenase content in lacrima.Methods　The morphological mutation of alkali burned cornea was obserred in the rabbit model.The collagenase content in lacrima was determined.Results　The collagenase content in lacrima went up gradually from the lst day to the 4th day,then run down piece by piece,finally uptrended a little in anaphase.Conclusion　There is a direct proportion between the variation of collagenase content in lacrima after cornea alkali burn and the area of corneal epithelial scarcity.

　　Key words　cornea;alkali burn;lacrima;collagenase

　　角膜碱烧伤是一种严重的化学性烧伤疾病，其造成角膜组织的损害有3方面：(1)碱性物质的直接破坏。上皮细胞坏死，碱性物质向深层组织渗透；(2)自由基的损害。角膜碱烧伤后，其创面主要为中性粒细胞浸润，受到激活后产生大量的氧自由基；(3)胶原酶对组织的溶解。后二者是继发性的，又是相互关联的，角膜组织厚度的90%是由实质层组成，实质层是由200个片层或胶原纤维束平行排列而成，其主要成份为胶原蛋白，胶原在胶原酶的作用下能完全溶解，加速角膜组织的软化和穿孔。为此我们在本次实验中对兔角膜碱烧伤后泪液中所含胶原酶量的变化进行了检测，同时与其角膜烧伤后形态学变化进行比较，给临床合理治疗碱烧伤提供依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　动物模型　日本大白兔，雌雄不限，健康无眼病，体重2.0～2.5kg，共计16只眼，由本院动物房提供。用直径9mm圆形滤纸，渗透2mol*L-1氢氧化钠，贴附于兔眼角膜中央区，时间1min，取下，用生理盐水冲洗2min。

　　1.2　形态学观察　24h后用20g·L-1荧光素染色，观察伤眼角膜处溃疡面积的大小及形态，1次·d-1，连续10d，并在观察后用2.5g·L-1氯霉素眼液滴眼，连续10d。

　　1.3　胶原酶检测法检测泪液中酶的含量　烧伤24h后，用吸取法收集泪液100μL，加入含有胶原的聚苯乙稀纤维板孔中，放入37℃温箱24h后，加入50mmol·L-1的EDTA-Na2100μL终止作用，时间5min，用0.2g·L-1考马斯亮兰100μL染色25min后用清水洗，然后在GXM-201酶标光度计590nm波长中检测，1次·d-1，连续10d，并于碱烧伤前用吸取法收集健康眼泪液100μL作对照检测，连续3d，检测时用9g·L-1生理盐水和胶原酶做阴性及阳性对照。

　　2　结果

　　2.1　烧伤24h后形态学变化　伤后1～3d，伤眼睁开困难、畏光、泪液及分泌物增多、结膜及睫状体充血(+++)，角膜创面Fe(＋)(荧光素染色阳性)约7～9mm2。d4～d6溃疡面逐渐缩小，Fe(＋)约2～3mm2。少数眼缩小至Fe(＋)1mm2为点状着色。d7～d10溃疡面积又扩大到5～6mm2，点状着色融合成片状着色。

　　2.2　碱烧伤后泪液中胶原酶含量的变化　在GXM-201酶标光度计中检测到伤后1d泪液中酶含量为40U，4d后逐步升至90U，从5～7d后逐渐降至40U，后期又有所上升。由此认为泪液中胶原酶含量与其病情形态方面的变化是相符的，对照组中健康泪液均未检测出胶原酶含量，见表1。

　　表1　兔角膜碱烧伤后上皮缺损与泪液中胶原酶含量的变化

　　3　讨论　　检测角膜碱烧伤后泪液中胶原酶的含量，对角膜烧伤机理研究是有帮助的，角膜碱烧伤1d后泪液开始含有胶原酶，含量直线上升，d4到最高，以后随着溃疡面积的缩小含量有所下降，到后期又有所回升，此改变与病情的反复成正相关，其机理是：烧伤后白细胞在12h内开始被受伤组织引起自身烧伤区趋化而出现浸润，3～5d达高峰，坏死组织的存在会促使多核细胞的阳性趋化作用，进入角膜基质的多形核细胞不断吞噬坏死组织的碎片，直到多形核细胞浆中充满异物和蛋白酶水解酶，此时多形核白细胞的结构即刻改变，膜的完整性丧失，导致膜功能障碍，进而使双层结构发生断裂，生物膜(细胞膜、线粒体膜、微粒体膜、溶酶体膜等)破溃，可释放出大量的溶酶体酶进入组织，对胶原组织产生溶解作用，其中可产生大量的超氧自由基，超氧自由基及其代谢产物可造成角膜多种组织成份如胶原、细胞膜脂质和蛋白质损伤，被超氧自由基破坏的角膜胶原组织反过来又能激活中性粒细胞的呼吸爆发过程，产生恶性循环。见图1，2。　

　　Figure 1 HE dicing after the third day of cornea alkali

　　burn(HE×100)show plenty of leucocyte gathering in the cornea stroma兔角膜碱烧伤后3d切片(HE×100)示：角膜基质中有大量白细胞浸润

　　Figure 2 HE dicing after the seventh day of cornea alkali

　　burn(HE×100)show some leucocyte gathering in the cornea stroma兔角膜碱烧伤后7d切片(HE×100)示：角膜基质中有白细胞浸润

　　许多研究认为多形核白细胞、成纤维细胞、角膜上皮细胞能产生胶原酶，从图1，2可见大量的多核白细胞浸润区，这说明体内PMN在吞噬杀菌过程中，一方面释放大量活性氧如超氧化物阴离子自由基、过氧化氢(H2O2)、氢氧自由基(·OH)以及单线态，它们均有强烈的氧化作用，既能杀菌，也可引起过氧化损害，另一方面又大量释放金属酶，包括胶原酶。因此认为大量多形白细胞在基质中积聚是基质发生溃疡的先兆，随着溃疡发生而产生的后弹力层膨隆及至角膜穿孔都和多形核白细胞在基质中的大量积聚密切相关。

　　碱烧伤的治疗初期应尽快清除碱性物质以减少组织破坏，随后除用抗菌素预防感染外，还要用清除自由基药物及胶原酶抑制药物，抑制多形核细胞的趋化作用和吞噬作用，最后还要用促进上皮生长和组织修复的药物。故在治疗上应采用综合性疗法，在不同的病程中应有所侧重。

　　作者简介　沈远平，女，出生于1956年2月，湖北孝感人，汉族，中专学历，主管技师。1974年入武汉同济医院护校学习，1976年毕业，在同济医院眼科从事护理工作，1990年调入眼科研究室，专门从事科研工作。在张泺教授的支持与指导下，先后在期刊上发表和在全国性学术会议上宣读科研论文10余篇。

　　参考文献

　　黄一飞.家兔角膜碱烧伤胶原含量变化及实验性治疗的影响.眼科研究1987；7(3)∶135.

　　朱志忠.眼的化学烧伤.国外医学眼科学分册1988；(1)∶38.

　　沈远平，张　泺.胶原酶的检测与巯基态抑制其作用的研究.同济医科大学学报1997；26(增刊)∶63.

　　收稿　1998-03-18　修回　1998-05-20