作者：刘卫，刘景东，庄甲举，张如春，马钢

　　Preparation of Willow Leaves Eye Washing Liquid and Experimental Study of its Effect of Anti-EV70

　　Abstract：ObjectiveTo make a kind of willow leaves eye washing liquid and observe its antivirus effect.MethodsEye washing liquid was made from fresh willow leaves by water extraction,extrafiltration and sterilization.Both infected by EV70 and non-infected single layer of MEK cells were treated by the eye washing liquid at diffferent concentration .ResultsIts highest harmless concentration used to treat the MEK cells was 25 percent of the original liquid.The EV70 proliferation was obviously inhibited through MEK cell treatment of eye washing liquid simultaneously EV70 infection.ConclusionWillow leaves eye washing liquid is a kind of effective antivirus agent.

　　Key words：Willow leaf;  Eye washing liquid;  Enterovirus70(EV70)
   
　　流行性出血性结膜炎（epidmic haemorrhagic conjunctivitis,EHC）是由肠病毒70型（enterovirus 70,EV70）感染所致的一种传染性极强的眼病，目前此病主要以抗病毒药物治疗，但效果不甚理想，根据民间验方研制了柳叶洗眼液。为了更进一步了解柳叶洗眼液的抗病毒作用，我们选择了对EV70敏感并能产生细胞病变的猴胚肾（MEK）传代细胞作为检测系统，观察该药物的体外抗病毒效果。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料UV265型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；柳叶Salix babylonica.L.（秋天现采现用或采集后低温放置）；邻苯二酚（优级纯含量99.9%）；其它试剂均为分析纯。

　　1.2  方法

　　1.2.1  柳叶洗眼液的制备

　　1.2.1.1  处方柳叶200 g，焦亚硫酸钠1 g，乙二胺四乙酸二钠0.3 g，总量1 000 ml。

　　1.2.1.2  制备方法取柳叶200 g，用常水洗后，再用蒸馏水洗，置玻璃烧瓶中，加水500 ml，加热提取1 h，滤出液体，药渣再加水500 ml，提取1 h，滤出液体，合并两次滤液。浓缩至500 ml，加95%乙醇1 000 ml，搅动匀，静置24 h，过滤，减压回收乙醇，至无醇味，加蒸馏水950 ml，焦亚硫酸钠1 g，乙二胺四乙酸二钠0.3 g，搅匀，用0.1 mol・L-1盐酸调pH 6~7，用0.3 μm滤膜抽滤，最后定容至1 000 ml，灌封于100 ml玻璃瓶中，100℃流通蒸汽灭菌30 min。

　　1.2.2  质量标准

　　1.2.2.1  性状本品为淡黄色透明液体。

　　1.2.2.2  鉴别取柳叶洗眼液50 ml，置分液漏斗，加入乙醚50 ml，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用乙醇定容至5 ml。另取邻苯二酚制成每2 g・L-1甲醇溶液，作为对照品。照薄层色谱法试验［1］，吸取教训上述两种溶液各2～10 μl。分别点于同一硅胶G薄层板上，以丙酮-25%氨水（99∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，于碘蒸气中放置1 min，在与对照品相应的位置上，供试品色谱分别显相同的红棕色斑点。

　　1.2.2.3  含量测定标准曲线的绘制：精密吸取邻苯二酚标准溶液（精密称取干燥至恒重的邻苯二酚10 mg,加95%乙醇5 ml溶解，加1mol・L-1盐酸5 ml，用水定容至5 ml）0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml量瓶中，分别加入1 mol・L-1盐酸2.4 ml，显色剂1 ml（亚硝酸钠10 g，钼酸钠15 g，加水溶解，定容至100 ml），1 mol・L-1氢氧化钠5 ml，用水定容至刻度，放置30 min，以水为空白，在波长（500±1）nm处测定吸收度。结果表明，邻苯二酚在1.5～9.0 μg・ml-1范围呈良好的线性关系，其回归方程为：A=0.081 7C+0.038 1，Y=0.999 6。含量测定：精密吸取柳叶洗眼液50 ml，置分液漏斗，加入乙醚50 ml，萃取3次，弃去水层，合并醚层，水浴回收乙醚，残渣用水定容至5 ml。精取1 ml，按标准曲线绘制方法测定吸度并计算含量。回收率实验：采用加样回收法，取已测含量的柳叶洗眼液适量，分别添加邻苯二酚，按柳叶的测定计算回收率，平均回收率为96.1%。RSD2.54%。

　　1.2.3  抗肠道EV70病毒的实验

　　1.2.3.1  细胞单层培养MEK传代细胞（由军事医学科学院五所微检中心细胞库提供），生长液1640含10%小牛血清，维持液1640含2%小牛血清，在37℃、5%CO2培养箱中，细胞培养24 h。

　　1.2.3.2  病毒EV70毒株名：AHC/J670/71（购自昆明医学生物所）。实验用病毒均为我实验室用MEK细胞传代第2代。

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