庄菁   余克明   Henning Willers   Hallahan Dennis E   葛坚   Fen Xia

中山大学中山眼科中心国家重点实验室   Department of Radiation Oncology   Vanderbilt University Medical Center   Nashville TN   510060

目的：确定Mre11在非同源末端连接中的作用。

方法：将含有两个I-Sce I 酶切位点的单拷贝底物转入HEK293细胞的染色体中，两个I-SceI核酸内切酶的依次表达同时形成两个具有互补末端序列的DNA双链断裂。通过siRNA 沉默来下调Mre11的表达。免疫共沉淀实验验证Mre11和DNA双链断裂末端相结合。通过细胞周期检测、同位素克隆生成实验、染色体非同源末端连接分析和结合序列分析来检测Mre11的功能。恢复实验中，含有DSBs底物的HEK293细胞转染野生型表达质粒、突变型Mre11，转染空质粒做对照(pcDNA3-Myc-Mre11-WT，pcDNA3-Myc-Mre11-R/A，pcDNA3-Myc-Mre11-3，pcDNA3-Myc，respectively)。48小时后，提取基因组DNA，real-time PCR检测染色体非同源末端连接。
结果：体外实验显示，Mre11与DNA双链断裂的染色质环绕位点相结合。抑制Mrell表达可提高IR敏感性，同时表现出DNA双链断裂修复缺陷。通过siRNA沉默Mre11表达，可导致D-NHEJ效率降低约4倍，但对C-NHEJ效率无影响。连接序列分析结果表明Mre11外切酶活性是D-NHEJ通路的关键。Mre11磷酸酯酶结构域和富含甘氨酸、精氨酸(GAR)结构域的突变降低其外切酶活性，因此减弱D-NHEJ通路。

结论：研究证明Mre11通过其外切酶活性，调节在连接前进行的DNA末端修饰。另外，磷酸酯酶和富含甘氨酸、精氨酸(GAR)的结构域在D-NHEJ中发挥重要作用。该研究为Mre11在哺乳动物细胞DNA修复机制提供了新的思路。