作者：侯玮玮, 蒋犁,乔立兴
作者单位：东南大学临床医学院, 江苏 南京 210009; 东南大学附属中大医院 儿科, 江苏 南京 210009
【摘要】目的 了解代谢性酸中毒诱导新生大鼠视网膜病变的发展进程,探讨其发生与血管内皮生长因子(VEGF)和胰岛素样细胞生长因子1（IGF1)的关系。 方法 模型组新生SpragueDawley大鼠80只，从出生后第2天开始按535 mg·kg-1的剂量管饲NH4Cl(质量浓度为50 mg·ml-1),每天2次,连续7d,然后进入恢复期;另选未行管饲的80只新生大鼠作为对照组。两组大鼠分别于出生后第3、5、8、10、13、20天处死。取出双眼进行视网膜铺片和二磷酸腺苷酶染色,对视网膜血管进行评估; 视网膜切片经常规HE染色定量反映视网膜血管增生情况;用免疫组化方法进行VEGF和IGF1测定。 结果 模型组大鼠在出生后第3、5、8、10、13、20天新生血管(NV)发生率分别为0、7%、24%、59%、23%、0。HE染色可见实验组10 d龄鼠有较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，平均每张切片有（14.67±2.16)个。而对照组未见或极少见突破内界膜的血管内皮细胞核,每张仅（0.87±0.75)个，两者比较差异有统计学意义（t＝18.47，P＜0.000 1)。出生后第10、13天,模型组鼠VEGF的蛋白水平比对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。出生后第8天,模型组大鼠视网膜IGF1的蛋白水平比对照组明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 代谢性酸中毒可能损害了正在发育的视网膜血管而引起新生血管;视网膜新生血管的发生与VEGF和IGF1的异常表达有关。
【关键词】 视网膜病 酸中毒 内皮生长因子 胰岛素样细胞生长因子 1 视网膜新生血管 疾病模型 大鼠
Expression of VEGF and IGF1 in rats model of acidosisinduced retinopathy
HOU Weiwei，JIANG Li，QIAO Lixing
(Clinical Medical College, Southeast University， Nanjing 210009,China;Department of Pediatrics, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009,China)
Abstract：Objective To analyze the expression and significance of vascular endothelial growth factor（VEGF)and insulinlike growth factor1（IGF1)in rats model of acidosisinduced retinopathy，and to elucidate the action of VEGF and IGF1 in the process of neovascularization in retinopathy of prematurity（ROP). Methods A total of 80 newborn SpragueDawley rats in experimental group underwent tubal feeding of NH4Cl(535 mg·kg-1) with the concentration of （50 mg·ml-1)(twice per day) from the second day after the birth for 7 days and followed by a period of recovery. Additional 80 neonatal rats were in the control group without the tubal feeding. The rats were executed at the 3rd,5th,8th,10th,13th,20th day after birth respectively. The retinal vessels were evaluated through retinal tretched preparation and adenosine diphosphatase (ADPase) staining. The newborn vessels were quantified by HE staining. VEGF and IGF1 in retina were detected by immunohistochemistry. Results In the experimental group, the incidence of retinal neovascularization(NV) at the 3rd,5th,8th,10th,13th,20th day after birth was 0,7%,24%,59%,23% and 0 respectively. In acidosisinduced retinopathy (AIR) group of 10day old, the number of neovascular nuclei extending into the vireo was 14.67±2.16,and that of the control group was 0.87±0.75, there was significant difference between the two groups (t=18.47,P<0.000 1). The result of immunohistochemistry revealed that in AIR grope the protein expression of VEGF was stronger than that of the control group on the 10th and 13th day. There was significant difference between the two groups(P<0.05). The protein of IGF1 was lower on the 8th day in AIR than that in control group. There was significant difference between the two groups(P<0.05). Conclusions Metabolic acidosis may induce NV by injuring the developing retinal vessels. Retinal NV induced by acidosis relates to VEGF and IGF1.
Key words：retinopathy of prematurity; acidosis; endothelial growth factors; insulinlike growth factor1; retinal neovascularization; disease models; rat
早产儿视网膜病（retinopathy of prematurity,ROP)是以视网膜异常新生血管为特征的疾病，是早产儿致盲的重要原因,约占儿童致盲原因的6%～18%[1]。许多研究证明，在高氧诱导的早产儿视网膜病新生鼠模型中血管内皮生长因子（VEGF）调控了ROP的主要病理过程[2]。尽管在严密控制用氧的情况下，早产儿视网膜病仍然是发达国家导致儿童视力损害的首要原因[3]。这说明除了高氧之外还有其他导致ROP的因素,其中酸中毒是除高氧之外导致早产儿视网膜病常见的高危因素[4]，且已用不同引起酸中毒的方法诱导新生大鼠长出视网膜新生血管[56]。本实验建立酸中毒诱导的新生大鼠视网膜病动物模型（AIR)，选择多个时间点观察视网膜病的发生和发展情况,并鉴于VEGF及胰岛素样细胞生长因子1（IGF1)在新生血管发生中的重要作用，探讨VEGF和IGF1在酸中毒引起视网膜新生血管动物模型中的变化规律及其在ROP新生血管化进程中所起的作用。
1 材料和方法
1.1 动物模型制作与分组
用新生SpragueDawley (SD)大鼠(购自复旦大学医学院)160只，雌雄不限，出生体质量为6.0～7.0 g，出生24 h内分为8组，每组20只，与1只母鼠共同饲养。任选其中4组从出生第2天开始按535 mg·kg-1的剂量管饲NH4Cl (质量浓度为50 mg·ml-1)，每天2次，连续 7 d，然后进入恢复期0～12 d[7]。另外4组作为同龄正常对照组，分别在出生后3、5、 8、10、13、20 d处死动物。控制室温在（23±2)℃，日光照明。
1.2 动脉血气和酸碱度测定及视网膜铺片观察（ADP酶组织化学法)
两组各时间点分别取5只新生鼠(10只眼)进行视网膜铺片，以观察视网膜血管发育及增生情况。具体方法为：用Avertin（0.01 mg·g-1)腹膜下注射麻醉， 打开胸腔,暴露心脏,用灌注针头刺入左心室,抽血0.5～1 ml进行血气分析，然后用生理盐水灌注 2～3 min,再用4%多聚甲醛溶液灌注约5 min。摘除新生鼠眼球,固定于4%多聚甲醛溶液中。在眼球角膜缘后约1 mm沿角膜缘环形剪开,去除角膜,取出晶状体,以视乳头为中心,作4或5个放射状切口,去除巩膜和脉络膜,用毛笔扫除玻璃体以及视网膜外层的色素上皮。用浓度为0.05 mol·L-1、pH值为7.2的Tris马来酸缓冲液冲洗5次,每次15 min。于37 ℃反应液中孵育15 min后用10%硫化铵反应5 min。光学显微镜下观察结果。
1.3 病理标本的制作
两组各时间点分别选取5 只新生鼠（10只眼)行颈椎脱臼处死,摘除眼球并标记方向。具体方法为:摘除的眼球放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明。在软石蜡中30 min、硬石蜡Ⅰ和硬石蜡Ⅱ中各浸蜡1 h。连续切片,厚度6 μm，切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位平面。将切片在温水中展平后用载玻片贴上，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水。常规HE染色，光学显微镜下观察结果。
1.4 视网膜新生血管内皮细胞核计数
每只眼球间断取10个病理切片,相邻2个切片间隔60 μm(10张切片),统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。
1.5 VEGF和IGF1免疫组化
VEGF一抗购于SANTA#CRUZ公司（SC7269)，工作浓度为1∶100;IGF1一抗购于武汉博士德公司，工作浓度为1∶50。SP9000通用型二抗试剂盒为武汉博士德公司产品，免疫组化染色步骤按SP试剂盒说明书要求常规操作,DAB蒸馏水溶液显色,显微镜下观察,控制反应时间,Mayer苏木精复染,二甲苯透明,中性树胶封片。VEGF和IGF1表达强度判断:以细胞浆着淡黄色至棕褐色颗粒为阳性细胞,阳性染色采用半定量分级,每张切片选取5个不重复的高倍视野(×400)计算阳性细胞的平均数,阳性细胞25%为+，26%～50%为++，51%～74%为+++,75%为++++。
1.6 统计学处理
所有数据均以SPSS 11.5统计软件进行分析。采用非配对t检验对同一时间点内两组进行分析,同组各时间点比较行方差分析。VEGF和IGF1的表达采用等级资料表示,利用等级资料秩和检验进行统计学分析。P<0.05作为差异有统计学意义。
2 结果
2．1 大鼠各时间点动脉血气及酸碱情况
在出生后第3、5、8、10、13、20天,模型组大鼠动脉血气pH平均值分别为7.002、7.136、7.048、7.460、7.470和7.450;血液碳酸氢根平均值分别为10.4、18.6、12.2、22.4、22.7和21.9 mmol·L-1。对照组大鼠动脉血气pH平均值分别为7.46、7.47、7.45、7.45、7.47和7.46;血液碳酸氢根平均值分别为22.5、22.6、22.2、22.2、22.6和22.5 mmol·L-1。
2.2 视网膜血管形态变化
新生大鼠出生时视网膜血管没有发育完全,随着时间延长,视网膜血管从中央不断向周边生长。对照组：幼鼠出生第5天视网膜血管以视乳头为中心，呈放射状均匀分布，管径较粗，周边血管网结构清晰，可见部分无灌注区;第8、10天时无灌注区逐渐减少;第13天时成熟的毛细血管网几乎覆盖整个视网膜，自视盘发出的大血管呈放射状均匀分布至视网膜周边，血管网深浅层结构清晰，表层血管呈均匀放射状，深层血管呈多角形网状结构(图1A)；第20天时视网膜完全血管化。模型组：出生第5、8天视网膜血管发育滞缓，管径变细，分支减少，中央部及周边出现大片无灌注区;第10天时自视盘发出的视网膜大血管明显扩张迂曲，大量新生血管形成，血管密度增高，但新生血管结构及分布紊乱，无放射状及多角形结构(图1B)；第20天时与对照组一样达到完全血管化。
B.模型组第10天,大血管迂曲扩张 A.对照组第10天,大血管呈均匀放射状分布
图1 两组大鼠视网膜血管形态变化 HE×100（略）
2.3 新生血管的发生率
模型组大鼠总的新生血管发生率为17%,对照组无一例发生新生血管。两组新生血管发生率差异有统计学意义(χ2=22.17,P=0.0000)。模型组在第3、5、8、10、13、20天新生血管的发生率分别为0、7%、24%、59%、23%和0。第10天时模型组视网膜新生血管数达到高峰。
2.4 两组大鼠视网膜血管增生比较
见图2。模型组10 d龄鼠HE染色切片有较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核，平均每张切片为（14.67±2.16)个;而对照组未见或极少见，每张仅（0.87±0.75)个，两者比较差异有统计学意义（t＝18.47，P＜0.000 1)。
A. 对照组.第10天，未见异常新生血管 B. 模型组第10天，可见突破基底膜异常新生血管
图2 两组大鼠视网膜血管异常增生情况 HE×400（略）
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