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2.5 两组大鼠视网膜VEGF蛋白表达水平比较
见图3。出生后第10、13天,模型组大鼠VEGF的蛋白水平比对照组明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。出生后第3、5、8、20天时,两组差异无统计学意义(P>0.05 ),见表1。
A. 对照组第10天 VEGF表达 B. 模型组第10天，VEGF表达比对照组明显增多 C. 对照组13天VEGF 表达 D. 模型组第13天，VEGF表达较对照组明显增多
图3 两组大鼠不同时间点视网膜细胞中VEGF表达情况 ×400（略）
2.6 两组大鼠视网膜IGF1蛋白表达水平比较
出生后第8天,模型组大鼠视网膜VEGF的蛋白水平比对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05);在出生后第3、5、10、13和20天,两组差异无统计学意义（P>0.05)，见表2、图4。
表1 两组大鼠视网膜细胞VEGF 表达强度比较（略）
表2 两组大鼠视网膜细胞IGF1 表达强度比较（略）
A. 对照组第8天IGF1 表达 B. 模型组第8天，IGF1表达较对照组减少
图4 两组大鼠不同时间点视网膜细胞中IGF1表达情况 ×400（略）
3 讨论
本实验建立酸中毒诱导的ROP大鼠动物模型，并利用新生鼠模拟早产儿观察代谢性酸中毒对视网膜血管的影响,是因为产后3周新生鼠的视网膜发育与人孕36周胎儿相似[8]。正常大鼠血气pH值为7.46±0.01，血液碳酸氢根为22.3±0.4 mmol·L-1[9]。本实验模型组在管饲NH4Cl期间（即生后第3～8天)，动脉血气分析结果示实验组pH值和碳酸氢根值明显低于正常参考值，处于代谢性酸中毒状态，证明建模成功。本实验动物模型中,大鼠的视网膜新生血管发生在视网膜血管区与无血管区的交界处,类似于人类ROP中新生血管的发生部位[10]。我们发现，新生SD大鼠经历酸中毒后视网膜的血管化程度落后于对照组,说明酸中毒可以抑制或损害发育中的血管;每天2次的NH4Cl管饲可能会存在2次剂量之间有一定的pH值恢复,有研究发现这种pH值的波动很小[11]。虽然没有恢复期也可以产生新生血管,但最多的新生血管是在恢复2 d后产生的。这与我们原先的假设是符合的,即酸中毒可能损害了正在发育中的血管。
VEGF作为血管内皮特异性的生长因子,是目前已知的最有力的促进血管生长的细胞因子,在血管生长过程中起中心调控作用[12]。在VEGF的正常表达作用下,正常视网膜血管才可能在生后进一步生长致最初的无血管区。以往的研究发现，在高浓度氧环境中,VEGF是下调的,而在相对低氧的环境中则上调,从而刺激了新生血管生长[13]。本研究结果显示,在酸中毒早期VEGF是下调的,而在恢复期,新生血管出现高峰之前VEGF明显上升。这与VEGF在高浓度氧条件下引起视网膜病变的情况类似,说明VEGF同样在酸中毒引起的视网膜新生血管中起重要作用。酸中毒调节VEGF的详细机制有待进一步研究。
IGF1对视网膜血管的正常发育是关键的。研究发现,IGF1的允许作用使VEGF能最大程度地诱导视网膜新生血管的生长,IGF1不足时,尽管有VEGF的存在也不能促进血管生长，在ROP病例中VEGF和IGF1之间变化关系与无ROP的早产儿是不同的，有其特殊的变化规律[1415]。Hellstrom等[16]和Smith等[17]发现患严重ROP的早产儿血清中IGF1的水平明显低于其他未患ROP的早产儿。在IGF1基因敲除鼠,尽管存在VEGF,但仍阻止了正常的视网膜血管生长,提示IGF1对正常血管发生的重要作用。本实验动物在管饲NH4Cl期间(出生后第8天)IGF1蛋白表达水平较对照组明显降低，低水平的IGF1影响了ROP期正常血管的发育。停止管饲NH4Cl 2 d后（出生后第10天)模型组IGF1蛋白表达回复到正常表达水平,即IGF1在视网膜新生血管最明显和VEGF蛋白表达最高峰时(出生后第10天)回复到正常表达水平。这与高二氧化碳高氧诱导的早产儿视网膜病变模型下IGF1的变化规律是一致的[18]。酸中毒调节IGF1的详细机制有待于进一步的研究。
尽管在高氧诱导的视网膜病变（OIR)与酸中毒诱导的视网膜病变（AIR)两种模型下存在着一些相似性：VEGF蛋白表达水平在视网膜新生血管最明显时达到最高峰。我们的实验证明VEGF 蛋白表达水平在两个模型下表达并不完全一致。在OIR模型下，高氧导致了VEGF蛋白水平明显下降，与正常对照组间存在显著性差异，而在AIR模型下，在管饲NH4Cl期间VEGF蛋白表达水平与正常对照组间并无显著性差异。这可能是因为两种模型是由不同的诱导因素所致，视网膜对不同刺激因素的反应是不同的。有研究发现，在OIR模型下，不论是高氧刺激还是低氧刺激都会导致动物发生突然的血气变化[19]。而在AIR模型下，有研究发现在管饲NH4Cl 12 h以后动物仍处于明显的酸中毒状态[20]。故在两种模型不同因素的刺激下导致了VEGF蛋白表达水平的不一致。
总之,本研究明确了在代谢性酸中毒诱导的视网膜异常新生血管动物模型中,视网膜血管化的程度和新生血管随时间的发展而变化,为利用这个模型进行其他机制和治疗研究提供了基础。同时,我们发现随时间变化,VEGF和IGF1均存在异常变化规律，说明在此模型中VEGF和IGF1同样起着非常重要的作用。
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