1.2.3 2/3角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼2/3面积角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成B实验组和B对照组，每组5只。B实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。B对照组不进行眼表重建手术。

    1.2.4 全角膜缘损伤眼表重建 兔10只，去除右眼全角膜缘上皮、角膜上皮和浅层基质，左眼上方取90°角膜缘组织备用，然后随机分成C实验组和C对照组，每组5只。C实验组行羊膜联合自体角膜缘移植术，方法同前。C对照组不进行眼表重建手术。

    1.3 术后处理和观察 各组手术眼每天滴0.25%氯霉素地塞米松眼液4次。定期观察各组动物术后眼表形态改变，28天后对各组动物进行评分，处死动物，取眼球行角膜组织学检查，以抗角膜上皮细胞特异性角蛋白K3的单克隆抗体AE5，对各组动物的角膜表面细胞进行免疫组化染色。

    1.4 眼表形态评分标准 （1）结合印迹细胞学检查结果观察结膜上皮化情况:1分，无结膜上皮化或少量结膜上皮化;2分，1/2以上角膜表面出现结膜上皮化;3分，3/4以上角膜表面出现结膜上皮化;4分，全部角膜表面出现结膜上皮化。（2）角膜新生血管情况:1分，无新生血管或新生血管位于角膜缘内2mm;2分，新生血管位于角膜周边，≤1/2角膜表面;3分，新生血管位于角膜周边，>1/2角膜表面;4分，全角膜可见新生血管。（3）角膜透明度情况:1分，角膜透明或轻度混浊，虹膜纹理可见;2分，角膜中度混浊，虹膜纹理不清;3分，角膜重度混浊，隐见瞳孔;4分，角膜极度混浊，瞳孔不见。本文数据采用SAS For Windows V8统计软件处理，统计学方法为Wilcoxon检验的确切概率计算。

    2 结果

    2.1 术后28天各组眼表形态改变 A实验组5只兔均未出现角膜结膜上皮化，A对照组4只兔结膜上皮化面积达1/2角膜面积，1只结膜上皮化面积达2/3角膜面积。B实验组4只兔未出现角膜结膜上皮化，1只出现1/2角膜面积的结膜上皮化。B对照组5只兔角膜结膜化范围达1/2角膜面积以上。C实验组5只兔均出现1/2以上角膜面积的结膜上皮化，C对照组5只兔角膜结膜化范围达2/3角膜面积以上。

    2.2 评分结果和统计学处理 评分结果见表1～3。以防治角膜结膜化为主要指标，统计学处理结果显示，A实验组与A对照组疗效比较差异有显著性（P<0.05），表明羊膜联合自体角膜缘移植对1/2角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;B实验组与B对照组疗效比较差异有显著性（P<0.05），表明羊膜联合自体角膜缘移植对2/3角膜缘受损的眼表损伤有治疗效果;C实验组与C对照组疗效比较差异无显著性（P>0.05），表明羊膜联合自体角膜缘移植对全角膜缘受损的眼表损伤无治疗效果。

    表1 各组角膜结膜上皮化评分和统计结果

    2.3 组织学检查 组织学检查显示A实验组和B实验组角膜表面有复层上皮，共4～5层细胞连续贴附于羊膜上，基底部细胞呈柱状，表面为扁平形，与正常角膜上皮结构基本相似，但较正常偏厚（图1）。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组可见结膜样上皮侵入角膜。

    免疫细胞化学染色显示A实验组和B实验组角膜表面细胞胞浆被染成棕黄色，能正常表达角膜上皮特异性角 蛋白K3（图2）。A对照组、B对照组、C实验组和C对照组染色阴性。

    表2 各组角膜新生血管评分和统计结果

    表3 各组角膜透明度评分和统计结果

    3 讨论

    Kenyon ［2］ 于1998年创立了自体角膜缘移植术，其原理是应用自体健眼的角膜缘替换功能缺陷的患眼角膜缘组织，通过供体植片内角膜缘干细胞的增殖、分化及向心性移动来修复、稳定受损眼表面，阻止新生血管的侵入和假性胬肉的形成。Tsai ［3］ 等在动物实验中发现健康的角膜缘上皮不仅能提供干细胞，还具有屏障功能，能显著抑制角膜新生血管，防止角膜混浊。本实验采用羊膜联合角膜缘干细胞移植分别治疗1/2和3/4角膜缘受损的动物，10只动物中9只术后获得稳定眼表面，而对照组所有动物均出现不同程度的结膜上皮化和新生血管侵入，表明自体的角膜缘移植能有效矫正患眼的干细胞失代偿状态，从而恢复受损的眼表面。

    角膜上皮细胞更新及再生的源泉是角膜缘干细胞，而角膜缘干细胞的增殖分化很大程度依赖于周围基质微坏境-干细胞壁龛的存在 ［3］ 。Tseng等对离体角膜上皮细胞的研究中发现，羊膜能起到干细胞壁龛的作用 ［4］ 。羊膜含有人体最厚的基底膜，其主要成分和眼表上皮细胞基底膜的成分相似，因此，在部分角膜缘受损，干细胞贮备受到破坏的情况下，移植的羊膜能抑制炎症反应，改善局部的微环境，促进损伤区周围的角膜缘干细胞增殖和分化，达到修复损伤的目的 ［5］ 。在角膜创伤愈合过程中，新生的角膜上皮细胞依靠表面受体与基底膜上的纤维连接蛋白结合进行附着和移动，反之则出现复发性上皮剥脱，羊膜的基底膜富含IV型和V型胶原和纤维连接蛋白，移植后能进一步促进上皮粘附，有利于创面修复 ［6］ 。

上一页  [1] [2]