作者：肖迎 作者单位：山东省立医院眼科， 山东 济南 250021
【摘要】 目的：观察神经节苷脂(monosialoganglioside，GM1)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后视网膜结构的保护作用及对核因子κB(nuclear factorkappaB, NFκB )表达的影响，探讨其可能的保护机制。方法：健康成年Wistar大鼠75只，随机分为3组：正常组5只、NS组35只、GM1组35只。正常组不加任何处理因素，NS组和GM1组通过升高眼压造成视网膜缺血60?min，分别于缺血前12、1?h及缺血结束时3次腹腔注射NS 3?ml·kg-1或GM1 3?ml·kg-1，并于再灌注0(单纯缺血后)、1、6、12、24、72和168?h共7个时点取双眼眼球，每时间点5只。HE染色观察视网膜组织结构并测量视网膜内层平均厚度(mean thickness of the inner retinal layers, MTIRL)，免疫组化SP法检测NFκB的表达并计算阳性细胞率。方差分析法进行统计处理。结果：大鼠视网膜缺血再灌注后，内层视网膜相继出现水肿和萎缩。再灌注后大鼠视网膜内层NFκB迅速激活，随后其表达逐渐下降。GM1可明显减轻视网膜缺血再灌注后的组织损伤，并显著抑制NFκB的活化。结论：NFκB活化可能是视网膜缺血再灌注损伤的早期始动因素。GM1对视网膜缺血再灌注损伤具有明确的保护作用，对NFκB的抑制可能是其保护机制之一。
【关键词】 神经节苷脂 视网膜 再灌注损伤 核因子κB
［ABSTRACT］ Objective: To investigate the protective effect of monosialoganglioside GM1 on rat retinal tissues and the influence of GM1 on NFκB after ischemiareperfusion injury. Methods: Seventyfive healthy adult Wistar rats were randomly divided into 3 groups: the control group(n=5), the NS group(n=35) and the GM1 group(n=35). The control group received no treatment. Rats in the other 2 groups received complete retinal ischemia by increasing the intraocular pressure for 60 minutes and they were intraperitonially injected to 3 ml·kg-1 NS or 3 ml·kg-1 GM1 at 12 and 1 hour before and immediately after ischemia. According to the survival time after reperfusion, the experimental 2 groups were subdivided into 7 time points: 0 (only ischemia), 1, 6, 12, 24, 72 and 168 hours after ischemia. Morphological changes and mean thickness of the inner retinal layers (MTIRL) of the retina were determined under light microscopy. Expression of NFκB was determined by the immunohistochemistry method. Results: Rats inner retinas had the lesion process of edema and atrophy after ischemiareperfusion injury. gradually decreased. Pathological changes of retina and activation of NFκB were obviously relieved by GM1. Conclusion: GM1 definitely protects against retinal ischemiareperfusion injury and it is a potential agent for retinal ischemiareperfusion injury.
［KEY WORDS］ Ganglioside; Retina; Reperfusion injury; NFκB 视网膜是眼部最复杂的结构，特殊的血供使其成为眼内最易遭受缺血再灌注损伤(ischemiareperfusion injury，IRI)的组织。核因子κB(nuclear factorkappa B，NFκB)是一种真核细胞转录因子，在心肌、脑、肝、肾等部位IRI中起重要的启动作用。单唾液酸四己糖神经节苷脂(monosialoganglioside，GM1)是从猪脑中提取的神经鞘脂，能从多方面促进神经元结构和功能的恢复，已广泛用于多种脑和脊髓损伤的治疗中，取得良好效果，但国内未见其在眼部应用的研究。本研究观察GM1腹腔注射后对大鼠视网膜IRI组织形态和NFκB表达的影响，探讨GM1可能的保护机制，为视网膜IRI的临床治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 健康成年Wistar大鼠75只，体重200 250?g，购于河南省实验动物中心。大鼠随机分为3组：正常对照组 (正常组) 5只、IRI＋生理盐水对照组(NS组)35只和IRI＋GM1治疗组(GM1组)35只。NS组和GM1组：将与164cm高无菌液柱相连的4 1/2号头皮针自大鼠角膜缘内侧刺入前房,升高眼压至120?mmHg(1?kPa=7.5?mmHg)维持60?min制成双眼视网膜IRI模型，并分别在缺血前12、1?h及缺血结束后3次腹腔注射生理盐水3?ml·kg-1或GM1 3?ml·kg-1。正常组未行任何处理。按观察时间的不同，将NS组和GM1组随机分为7个时点，分别为再灌注0(单纯缺血)、1、6、12、24、72、168?h，每时点5只，取眼球进行观察。
GM1(施捷因)注射液：阿根廷Trb Pharma s.a药厂生产，进口注册证号：X19990445，广州精优惠南医药有限公司惠赠，浓度为10?mg·ml-1。其它试剂为分析纯级。
1.2 方法
1.2.1 光学显微镜检查及形态学测量 常规固定、脱水、包埋，经视神经行前后方向切片，常规HE染色，光镜观察。每眼选取切片2张，测定距视神经两侧1mm处由内界膜至外丛状层内侧之间的视网膜厚度，取平均值即为视网膜内层平均厚度(mean thickness of the inner retinal layers，MTIRL)。
1.2.2 免疫组织化学SP法染色 常规固定、脱水、包埋、经视神经切片，3%H2O2室温孵育、抗原热修复、5%山羊血清封闭各10?min。1∶100稀释的NFκB p65一抗37?℃孵育1?h，生物素标记的羊抗兔IgG及辣根酶标记链霉卵白素工作液室温孵育各20?min，DAB显色，苏木素复染。油镜下(×1?000)观察：胞浆黄染为NFκB表达，胞核中有棕黄色颗粒者为NFκB活化。每眼选2张切片，从周边至后极任选5个视野，计算每个视野下的阳性细胞率，取平均数即为该样本的NFκB阳性率。用已知阳性的组织切片，以PBS代替一抗作空白对照。以正常兔血清代替一抗作阴性对照，结果均为阴性。
1.3 统计学处理 MTIRL和NFκB阳性率用±s表示，应用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)。
2 结 果
2.1 光镜检查结果 见图1、表1。由图1及表1可见，正常组大鼠视网膜层次清楚，染色均匀，内核层约4 5个胞核厚度，外核层约10 12个胞核厚度(图1A)。
NS组：缺血后视网膜轻度水肿；再灌注后内层视网膜继续增厚(P＜0.05)；再灌注6?h水肿达高峰(P＜0.01)，内丛状层疏松，内核层部分细胞固缩，核周空泡(图1B)；12?h水肿减轻(P＜0.05)，24?h厚度正常(P＞0.05)，节细胞及内核层出现大量深染胞核；再灌注72?h视网膜轻度变薄(P＜0.05)；168?h内层视网膜明显萎缩(P＜0.01)，节细胞排列稀疏，内丛状层几乎消失，内核层余1 2层，结构及排列紊乱(图1D)。
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