作者：王建文 作者单位：哈尔滨医科大学附属第一医院眼科，黑龙江 哈尔滨 150001
【摘要】 目的： 构建Pro370Leu突变型Myocilin（MYOC）基因真核表达质粒，并在COS7细胞中表达以探讨突变蛋白表达特点. 方法： 以pGEMTMYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因(mutant MYOC,mMYOC)，并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2N1上，得到pDsRed2N1mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染COS7细胞，进行荧光显微镜观察. 采用Western Blot分析蛋白分泌情况并检测突变蛋白对细胞凋亡的影响. 结果: 经酶切和DNA序列测定，第370密码子CCG转变为CTG，荧光显微镜观察显示mMYOC蛋白只定位在细胞质中，经Western Blot分析表明mMYOC蛋白只存在细胞裂解液中，经流式细胞仪检测突变型转染组凋亡细胞百分比较高为6.63%. 结论： Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒构建成功，Pro370Leu突变型MYOC基因表达的蛋白呈分泌障碍状态，并具有促进细胞凋亡的趋势.
【关键词】 MYOC基因 定点突变 凋亡 青光眼 开角型
0引言
原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma ，POAG)是主要致盲眼病之一，有研究发现POAG发病具有明显的遗传性. 1997年Stone等首次克隆了POAG的致病基因：Myocilin(MYOC)基因，该基因是迄今研究最多的与POAG相关基因，已经发现有几十种突变型与POAG致病相关，如我国发现的Pro370Leu，T455KmMYOC基因等，并对其进行了初步研究［1-2］. 本研究选择Pro370LeumMYOC基因，构建其真核表达质粒，转染COS7细胞，研究其是否有促进细胞凋亡的作用，以阐明MYOC基因突变所致的POAG发病机制.
1材料和方法
1.1材料FACSCalibur（美国BD公司）BamHI，EcoRI（美国NEB公司）；Superfect转染试剂盒（美国Invitrogen公司）；DsRed Monoclonal Antibody（mouse)，pDsRed2N1质粒（美国Clontech公司）；兔抗鼠IgGHRP（上海华美公司）； DH10b菌株和COS7细胞株（上海睿星基因公司）；pGEMTMYOC［3］（由作者构建）；上游引物AF:5′aaaagaattctg ATGAGGTTCTTCTGTGCACGTTGCTG3′；下游引物AR:5′ aaaaggatcCATCTTGGAGAGCTTGATGTCATAAGTG3′,上游突变引物MF:5′ GGCTACCACGGACAGTTCC（T突变点）GTATTCTTGGGGTG3′；下游突变引物MR:5′CACCCCAAGAATAC（A突变点）GGAACTGTCC GTGGTAGCC3′（引物由由上海生物工程公司合成）.
1. 2方法
1.2.1mMYOC基因片段克隆以pGEMTMYOC质粒中MYOC基因为模板，进行两次PCR反应完成定点突变，连接反应得到Pro370LeumMYOC基因. 第1次PCR反应引物为AF， MR；第2次PCR反应引物为MF，AR. 反应体系：10×PC R buffer 5 μL，模板pGEMTMYOC质粒100 ng，引物AF（MF）3 μL , 引物MR（AR) 3 μL，耐热Taq DNA聚合酶25 nkat，4种dNTPs（20 mmol/L）1 μL,补双蒸水至50 μL，然后94℃预变性2 min，94℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，共30个循环，最后72℃延伸10 min，以水代替模板作为对照. 将两次PCR产物各取2.5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，以紫外分光光度计定量备用. 用QIAquick 8 PCR Purification Kit纯化PCR产物，以AF，AR为引物进行连接PCR反应，经纯化得到完整的突变型基因mMYOC，用紫外分光光度计定量备用.
1.2.2pDsRed2N1mMYOC质粒构建及鉴定取适量纯化的mMYOC基因片段和pDsRed2N1质粒，分别用限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切. 进行连接反应将mMYOC基因片段亚克隆导入pDsRed2N1质粒，构建重组表达质粒pDsRed2N1mMYOC.
1.2.3pDsRed2N1mMYOC质粒转染COS7细胞常规培养传代，在6孔板内接种COS7细胞株，每孔约(1.5～2.5)×105个细胞，37℃，50 mL/L CO2培养过夜，至细胞60%～70%融合，采用脂质体转染法，分别采用pDsRed2N1mMYOC质粒和pDsRed2N1空质粒转染COS7细胞，每种质粒转染两个孔，以未转染的细胞为筛选对照，转染后5 h换液，在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中培养，并于转染48 h后用荧光显微镜观察.
1.2.4Western Blot检测收集上述转染pDsRed2N1mMYOC质粒细胞上清液和细胞裂解液，变性后经10 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，封闭后，加入1∶500鼠源的抗红色荧光蛋白的mAb 4℃过夜, 兔抗鼠IgGHRP二抗检测杂交蛋白，DAB显色.
1.2.5流式细胞术检测转染后48 h，将pDsRed2N1mMYOC转染组，pDsRed2N1空载体转染组及空转染组COS7细胞消化成单细胞悬液，400目滤网过滤，离心，无水乙醇固定，加入1 g/L 核糖核酸酶I 200 μL ，37℃孵育30 min，加800 μL 荧光燃料染色液混匀后4℃避光染色30 min；应用FACSCalibur流式细胞仪计算细胞凋亡百分率. 结果以lysisⅡ软件分析，比G1期细胞DNA含量少的细胞确定为凋亡细胞.
2结果
2.1定点突变PCR第1次和第2次PCR反应，经琼脂糖凝胶电泳显示分别得到1100 bp和400 bp的片段（图1A）；连接反应PCR经电泳得到约1500 bp的突变目的基因片段（图1B），与预期相符.
A1：第1次PCR反应；2：第2次PCR反应; B1：连接反应PCR；M：100 bp标准相对分子质量.
图1PCR反应产物经琼脂糖凝胶电泳（略）
2.2pDsRed2N1mMYOC质粒构建及鉴定利用酶切后产生的质粒和片段之间互补的粘性末端进行亚克隆，构建的pDsRed2N1mMYOC质粒用限制性内切酶EcoRΙ和BamHΙ双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，得到1500 bp插入的mMYOC片段和4700 bp的质粒片段（图2）；测序结果显示第370密码子由原来CCG变成CTG（图3），与预期结果相符.
M：100 bp DNA Ladder 标准相对分子质量； 1：pDsRed2N1mMYOC酶切条带.
图2pDsRed2N1mMYOC融合表达质粒的双酶切电泳（略）
2.3pDsRed2N1mMYOC在COS7细胞中表达转染48 h后荧光显微镜观察结果显示，pDsRed2N1mMYOC转染组及pDsRed2N1空载体转染组均有红色荧光. pDsRed2N1空载体转染组红色荧光均匀分布在整个细胞（图4A），而pDsRed2N1mMYOC转染组红色荧光定位在细胞质中并呈颗粒状分布（图4B）.
图3mMYOC基因第1089-1123碱基测序结果（略）
A： pDsRed2N1空载体转染组； B：pDsRed2N1mMYOC转染组.
图4荧光显微镜观察pDsRed2N1和pDsRed2N1mMYOC载体的表达×200（略）
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