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2.4mMYOC蛋白表达变化细胞的裂解液中检测到Mr约为81 ku的蛋白，与mMYOC和红色荧光蛋白结合的融合蛋白大小一致，在细胞培养液中未检测到目的蛋白（图5）.
1：细胞裂解液; 2：细胞培养液.
图5Western Blot检测mMYOC蛋白表达（略）
2.5细胞凋亡率 经流式细胞仪检测空转染组，pDsRed2N1空载体转染组，pDsRed2N1mMYOC转染组的细胞凋亡率分别为0.65%，1.10%和6.63%（图6）. pDsRed2N1mMYOC转染组细胞凋亡率明显高于空转染组和pDsRed2N1空载体转染组.
3讨论
POAG发病特点是前房角开放、小梁途径的房水外流受阻、眼压升高、视野变小以及视神经萎缩. 其中房水外流受阻引起IOP升高是已知的POAG发病的最明显危险因素［4］，可导致视网膜神经节细胞的慢性进行性损伤，造成视功能不可逆性丧失. 基因学研究［5］表明，MYOC基因的突变在高IOP相关的 POAG中发挥关键性作用. 大多数引起POAG的MYOC突变体同野生型MYOC不同，它们错误折叠，异常聚集滞留在细胞内，导致其分泌受阻,分泌受阻进一步引起MYOC蛋白聚集，这与本实验结果一致. 改变了小梁网外流通路上的细胞外基质成分，使得大量体液外流受阻.
A：空转染组； B：pDsRed2N1空载体转染组； C：pDsRed2N1mMYOC转染组. 蓝色：细胞凋亡率；红色：G1期二倍体细胞数或G2期四倍体细胞数.
图6转染48 h后各组流式细胞仪检测结果（略）
Pro370Leu突变型MYOC蛋白既未被分泌,也未被降解,而是以积聚体的形式存在于胞质内,蛋白质分泌过程是在核糖体中合成后，经内质网加工处理，再通过高尔基体分泌到细胞外. Pro370Leu突变型MYOC蛋白异常聚集和分泌障碍很可能就发生在内质网中. 内质网中糖蛋白的折叠状态由蛋白质质控系统监测［6］. 不能正确折叠的糖蛋白滞留在内质网中，或保存于此，或逆向定位经泛素－蛋白酶体系统降解［7］. 滞留在内质网中的异常蛋白增多到一定程度或当逆向定位的非正确折叠蛋白超过泛素－蛋白酶体系统降解极限，就会造成细胞内小体聚集［8］. 正是由于Pro370Leu突变型MYOC蛋白在内质网中积聚使其产生的压力反应导致了细胞的凋亡性死亡，本实验结果显示Pro370Leu突变型MYOC蛋白有促进细胞凋亡的倾向，凋亡可能是MYOC突变引起的POAG发生和发展中的一个主要致病因素. 这种由基因突变导致蛋白质的错误折叠，从而引起细胞凋亡的疾病有很多，例如囊肿性纤维化，抗胰蛋白酶缺陷，尿崩症，成骨不全症，帕金森病，老年痴呆症等［9-10］.
Pro370Leu突变是发生在MYOC基因第三外显子上，该外显子为嗅素同源区，具有重要功能，可对蛋白代谢和分泌通路进行严格的调控. 通过生物信息学分析发现,MYOC蛋白第370位脯氨酸高度保守, 位于MYOC基因溴素同源区,该区域是一个重要的转移暂停区,为分泌型蛋白的关键区域［11］,Pro370Leu突变型使得原来的脯氨酸变成亮氨酸，脯氨酸为亚氨基酸，并且脯氨酸残基主要参与构成蛋白质二级结构的转角结构，由这样物理性质相差较大的氨基酸在蛋白质的保守位置上互相替换，将会导致蛋白质的功能区在空间构象等结构和理化性质方面发生改变. 据此可推测该部位的突变可能导致多肽链折叠错误,无法从内质网进入细胞外的分泌通路,从而引起细胞凋亡等改变，最终导致POAG的发病.
【参考文献】
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