作者：许玉花,刘 燕，张金玲 作者单位：通化市眼科医院，吉林 通化 134001
【摘要】 目的：探讨大鼠视网膜缺血再灌注损伤后bcl-2和baxmRNA的表达变化及其意义。方法：采用升高眼内压的方法，制作实验性视网膜缺血再灌注大鼠模型。将30只Wistar大鼠随机分为正常组（n=4）和缺血再灌注组（n=16），其中缺血再灌注组又分为再灌注后2、6、24、72h等4个时间段（每时间段4只）。应用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测视网膜组织中bcl-2和baxmRNA的表达变化。结果：视网膜组织内bcl-2mRNA的表达水平在缺血再灌注损伤后2h时即开始下降，6h时降至最低，持续至第72h，与正常组相比有显著差异（P<0.01）。与bcl-2的表达相反，baxmRNA的表达呈上升趋势，6h时达最高，72h时仍显著高于正常组（P<0.01）。结论：bcl-2和bax可能参与了缺血再灌注损伤所造成的视网膜细胞的凋亡过程。
【关键词】 视网膜；缺血再灌注损伤；bcl-2；bax；反转录聚合酶链式反应
Changes in expression of bcl-2 and bax mRNA after ischemia-reperfusion injury in rat retina and its significance
XU Yu-hua1，LIU Yan2，ZHANG Jin-ling3 (1.Tonghua Ophthalmology Hospital，Tonghua 134001，China；2.Department of Ophthalmology，Tangdu Hospital of Fourth Military Medical University，Xi'an 710038，China；3.Department of Ophthalmology，the Second People's Hospital of Fusong County，Baishan 134504，China)
Abstract：Objective To investigate the changes in expression of bcl-2 and bax mRNA after ischemia-reperfusion injury in rat retina and its significance. Method The rat model of experimental ischemia-reperfusion injury in retina was made by method of increasing intraocular pressure. 30 Wistar rats were divided into the normal group (n=4) and the ischemia-reperfusion injury group (n=16). The latter group was subdivided into four time points as 2, 6, 24 and 72 h after reperfusion (n=4/time point). The expression of bcl-2 and bax mRNA in rat retina was detected by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) technique. ResultsThe expression level of bcl-2 mRNA in rat retina began to decrease 2h after ischemia-reperfusion injury, reached to the lowest at 6h, and lasted to 72h, and was significantly different with that in the normal group (P<0.01). In contrast to the expression of bcl-2, the expression of bax mRNA increased after ischemia-reperfusion, reached the peak at 6h, and kept a higher level to 72h, also had significant difference with the normal group (P<0.01). Conclusion Bcl-2 and bax may involve in the apoptotic process of retina neurons induced by ischemia-reperfusion injury.
Key Words：Retina；Ischemia-reperfusion injury；Bcl-2；Bax；RT-PCR
视网膜缺血再灌注损伤（retina ischemia/reperfusion injury）是一种较为常见的病理过程，临床上许多疾病均可引起视网膜的缺血再灌注损伤，如：视网膜中央动脉阻塞、分支动脉阻塞、视网膜中央静脉/分支静脉阻塞、缺血性视神经疾病、早产儿视网膜病变等。它们均可造成不同程度的视网膜缺血，在缺血再通后，视网膜反而受到更为严重的损伤，造成视功能下降［1,2］。因此，加强对视网膜缺血再灌注损伤机制的研究是非常重要的。既往研究认为，缺血再灌注损伤后视网膜成分的丢失可能涉及视网膜细胞凋亡［3］，但是引起细胞凋亡的机制尚未完全阐明。本实验通过建立大鼠的视网膜缺血再灌注损伤模型，动态观察了视网膜内bcl-2和bax mRNA的表达变化，探索bcl-2和bax在视网膜缺血再灌注损伤中的可能作用，为临床治疗视网膜缺血再灌注损伤类疾病提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物及试剂：成年健康Wistar大鼠20只，由第四军医大学实验动物中心提供。雌雄不拘，体重270～300g，室温环境饲养。TRIzol试剂、SuperscriptII反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、DL2000DNA标志物购自Takara公司;bcl-2、bax和β-actin引物由上海生工技术有限公司合成。
1.2 视网膜缺血再灌注模型的建立：动物随机分成两组：正常对照组（4只）和缺血再灌注组（16只）。缺血再灌注组又分为再灌注后2、6、24、72h等4个时间段（每时间段4只大鼠）。以前房灌注升高眼压的方法制备大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型，具体方法为：大鼠以水合氯醛麻醉(400mg／kg体重)，将生理盐水瓶连接输液器，升高输液瓶至于大鼠眼垂直距离为150cm左右处，灌注压力达到110mmHg(14.63kPa)。将连接输液器的7号头皮针自大鼠颞侧角膜缘穿刺入前房，手术显微镜直视下可见灌注压平衡后，视网膜苍白水肿，表明视网膜中央动脉供血已被完全阻断。60min后降低液瓶高度至27cm以下(<20mmHg)，此时可见视网膜变红，表明视网膜血管重新开放，已形成再灌注。此时拔出前房灌注针头，再灌注计时开始。
1.3 视网膜内bcl-2和bax mRNA的检测
1.3.1 总RNA提取正常对照组动物、缺血再灌注后第2、6、24和72h的动物在水合氯醛麻醉下，经心脏灌流焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的生理盐水，以冲净血液。取出双侧眼球，快速分离出视网膜，置于液氮中冷冻，采用异硫氰酸胍法提取总RNA。
1.3.2 引物设计及合成按照已报道的序列设计并合成bcl-2、bax以及内参照β肌动蛋白β-actin)的特异性引物。各引物的序列为：bcl-2：上游引物5'-CTCGTCGCTACCGTCGTGACTTCG-3'，下游引物5'-CAGATGCCGGTTCAGGTA CTC AGT C -3'；bax：上游引物 5'-AAG CTG AGC GAG TGT CTC CGG CG-3'，下游引物 5'-GCC ACA AAG ATG GTC ACT GTC TGC C-3'；β-actin：上游引物 5'-TGG TGG GTA TGG GTC AGA AGG ACT C-3'，下游引物 5'- CAT GGC TGG GGT GTT GAA GGT CT CA-3'。利用上述引物推导的PCR产物的大小分别为，bcl-2：376 bp；bax：284 bp；β-actin：265 bp。
1.3.3 RT-PCR反应 在50 (L的反应体积中加入5 μg总RNA，5×反应缓冲液10 μL，10 mmol/L dNTPs 5 μL，RNasin 20 U，oligo (dT)12-18 0.25 μg，M-MLV反转录酶200 U，0.1 mol/L DTT 0.5 (l，置37℃孵育1 h以反转录合成cDNA。以下列反应体系进行PCR扩增：在25 μL反应体积中加入cDNA 0.1 μg，10×PCR缓冲液2.5 μL，2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，各引物20 pmol，Taq DNA聚合酶 (Takara) 5 U。循环条件：93℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，33个循环。扩增产物经3%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，用凝胶成像系统进行观察。
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