作者：刘双珍 作者单位：中南大学湘雅医院 眼科，湖南 长沙 410078；
【摘要】 目的 对豚鼠行形觉剥夺建立近视动物模型，观察离子型谷氨酸受体N－甲基－D－天冬氨酸受体1(N-methyl-D-aspartate receptor 1，NMDAR1)在近视豚鼠视网膜上的动态表达，探讨其在近视发病机制中的作用。方法 60只三色豚鼠随机分为3组：未遮盖组（Ⅰ）、单眼遮盖2周组（Ⅱ）、单眼遮盖3周组（Ⅲ），其中右眼遮盖为实验眼，左眼为自身对照眼。对各组进行视网膜检影和A超测眼轴，分别运用免疫组化及 Western Blotting法检测各组豚鼠视网膜NMDAR1蛋白表达。结果 Ⅰ组双眼呈轻度远视状态，双眼眼轴差异无显著性（P>0.05）；Ⅱ组实验眼呈轻度近视（-1.583±1.478）D，自身对照眼呈轻度远视（2.500±1.017）D;实验眼眼轴较自身对照眼轻度延长（P<0.05）；Ⅲ组实验眼呈中度近视 (-3.417±1.169）D，自身对照眼呈轻度远视（1.813±1.072）D；实验眼眼轴较自身对照眼明显延长（P<0.05）。免疫组化显示NMDAR1主要表达在豚鼠视网膜的内核层细胞及神经节细胞。Ⅰ组实验眼视网膜上NMDAR1蛋白含量为0.338±0.314，Ⅱ组实验眼NMDAR1蛋白含量升高为0.464±0.280，Ⅲ组实验眼视网膜NMDAR1蛋白含量明显上调为0.635±0.037；实验眼视网膜上NMDAR1蛋白含量随遮盖时间延长明显上调，与自身对照眼比较差异有显著性（P<0.05）。结论 形觉剥夺可明显上调豚鼠视网膜NMDAR1的蛋白表达，形觉剥夺产生的异常视觉信号可能通过刺激谷氨酸的释放、NMDAR1过度生成，参与近视的调控。
【关键词】 形觉剥夺性近视 视网膜 豚鼠 N－甲基－D－天冬氨酸受体1 谷氨酸
在视觉发育可塑性关键期，对实验动物予以形觉剥夺，可引起视网膜第一信使改变，并通过一定的信号传导途径作用于靶细胞发挥效应，形成近视。以往对形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia, FDM）的研究显示视网膜上多种信息分子均可能与眼轴生长及视觉发育有关。谷氨酸作为视网膜垂直信号传递系统的最重要的兴奋性氨基酸神经递质，可通过与N－甲基－D－天冬氨酸受体 (N-methyl-D-aspartate recepter，NMDAR)结合，在视觉可塑性变化、视网膜环路发育、兴奋性突触传递及视网膜电化学信号的传递中发挥重要作用[1]。本研究通过观察FDM豚鼠视网膜上谷氨酸受体NMDAR1的表达，探讨谷氨酸及其受体在近视发病机制中的作用。
1 材料和方法
1.1 实验动物与分组 3周龄三色豚鼠(购自中南大学动物部动物研究所)60只,随机分为3组，每组20只。Ⅰ组：未遮盖组，Ⅱ组：右眼遮盖2周组，Ⅲ组：右眼遮盖3周组。
1.2 实验方法
1.2.1 形觉剥夺性近视（form-deprivation myopia，FDM）模型的建立 右眼为实验眼，予以不透明眼罩遮盖形觉剥夺；左眼为自身对照眼[2]。
1.2.2 屈光度检测 在实验前、实验第2周、实验第3周对各组进行屈光度检查。检查前1 h双眼滴0.25%托吡卡胺眼液以麻痹睫状肌，验光师行双盲法暗室内视网膜检影镜检影，每只眼检影3次，取平均值测眼屈光度数,有散光者用等效球镜表示。
1.2.3 眼轴长度检测 在各实验时间对各组豚鼠以1%的卡因进行眼球表面麻醉,用A超测定眼轴长度，连测3次,取平均值。
1.2.4 免疫组化 各实验时间行屈光度与眼轴测量后每组随机取10只豚鼠断颈处死，快速摘除双侧眼球，去除玻璃体及眼前段，将后极部视网膜置于10%中性福尔马林液中常规固定、脱水、石蜡包埋、切片。脱蜡入水，浸入室温下3%H2O2中10 min，PBS洗3 min×3次；0.01 M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）微波炉加热沸腾后2 s断电，切片浸入枸橼酸盐缓冲液的密闭微波炉内焖5 min，再将微波炉加热 20 s断电，再焖40 min，自然冷却；滴加正常血清封闭液37℃烤箱30 min，0.5 ?滋g/ml鼠抗NMDAR1多克隆抗体(购于美国Chemicon公司)，4℃过夜；PBS洗3 min×3次；滴加羊抗鼠IgG，37℃烤箱30 min， 0.1 M PBS洗3 min×3次，滴加SABC，37℃烤箱 30 min，0.1 M PBS洗3 min×3次，DAB显色，镜下控制显色时间，苏木素复染，封片下光镜观察。结果判定：胞浆呈明显棕色反应为阳性,根据染色深浅和阳性细胞百分比, 将阳性强度判断为弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)。
1.2.5 视网膜总蛋白提取 将各组余下的10只豚鼠断颈处死，摘除双侧眼球，去除玻璃体及眼前段，剥离后极部视网膜并用电子天平称重，无菌研钵内加液氮，将视网膜研碎后转入EP管；按1 ∶ 8重量体积比于EP管内加入对应视网膜重量的组织裂解液，冰浴上塑料研棒进一步研磨裂解视网膜组织 1 h。冰上超声裂解，每次3 s，间隔1 s，超声2次；EP管置沸水浴中5 min。12000 r/min，4℃离心15 min，吸取上清至另一管中，分装成小管存于-20℃。
1.2.6 Western Blotting分析 参照《分子克隆实验指南》第2 版，BCA法测定蛋白浓度，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移法转移蛋白至PVDF 膜上，丽春红S染色，对比蛋白质Marker将所需测定片断和β-actin片断滤膜剪下，5%脱脂牛奶封闭液室温下孵育4 h，洗膜液洗膜5 min×3次，封闭液稀释的一抗NMDAR1(1:100)4℃ 振摇过夜。洗膜液洗膜 5 min×3次，加入封闭液稀释的羊抗鼠IgG二抗 （1 ∶ 500），37℃孵育2 h。倾去二抗，用洗膜液洗膜 5 min×3次，加DAB显色。用ImageJ1.36图像分析软件对结果灰度扫描，以β-actin做内对照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。计算方法为：目的蛋白质相对表达量＝目的蛋白条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件包，组间差异用one way ANOVA检验，两两比较采用LSD法检验; 左右眼差异应用配对t检验比较。
2 结果
2.1 屈光度变化 形觉剥夺可明显促进近视形成和发展。未遮盖组，双眼呈轻度远视状态；遮盖2周组实验眼呈轻度近视（-1.583 D）；遮盖3周组，实验眼呈中度近视状态(-3.417 D)。各组自身对照眼屈光度无明显变化(见表1)。
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