作者：张莹,张明昌,何 志 作者单位：(430022)中国湖北省武汉市，华中科技大学同济医学院附属协和医院眼科
【摘要】 目的:探讨检测大鼠角膜碱烧伤后新生血管形成过程中β连环蛋白(βcatenin)的表达变化。方法:使用碱烧伤诱导左眼角膜新生血管模型，SD大鼠25只随机分成5组，使用碱烧伤诱导左眼角膜新生血管模型，将右眼作为对照组，每日裂隙灯下观察角膜新生血管的发展，并采用免疫组织化学和逆转录聚合酶链反应(reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RTPCR)方法，分别检测碱烧伤1，4，7，14，21d组以及正常对照组βcatenin和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达。结果:在正常大鼠角膜组织中，βcatenin不表达或弱表达，碱烧伤后1d时，βcatenin免疫活性开始增强，4d时表达最强，14d时下降，21d时仍有弱表达。RTPCR显示碱烧伤后βcatenin表达增强，在伤后4d表达最明显，21d后呈极弱表达。VEGF与βcatenin表达分布相似，强度较弱，二者之间呈正相关(r=0.855，P<0.05)。结论:角膜碱烧伤后，βcatenin表达水平与新生血管形成明显相关性。
【关键词】 βcatenin;血管内皮生长因子;角膜碱烧伤;新生血管
作者简介：张莹，硕士研究生，研究方向：角膜病。
Expression of βcatenin in rat corneal neovascularization after alkali burn
Ying Zhang, MingChang Zhang, Zhi He
Department of Ophthalmology, Union Hospital of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,Hubei Province,China
Abstract
AIM: To investigate the expression of βcatenin in cornea after alkali burn and explore its role in corneal neovascularization.
METHODS: Corneal neovascularizalion (CNV) model was established by putting filter paper with the size of 3 mm in diameter immersed in 1mol/L NaOH solution on the rat left cornea for 20 seconds. Twentyfive Sprague Dawley rats were randomly divided into 5 groups: postoperation 1 day, 4, 7, 14 and 21 days group while right eyes as normal control group. The expression level of βcatenin protein and mRNA was determined at 1 day, 4, 7, 14, 21 days following establishmend of model by RTPCR and immunohistochemical technique.
RESULTS: There was no evident βcatenin immunoreactivity in normal cornea. Both expression of βcatenin and vascular endothelial growth factor(VEGF) peaked in 4 days and gradually decreased to near baseline 21 days later. Alteration of βcatenin and VEGF levels showed a significant positive correlation(r=0.855, P<0.05).
CONCLUSION: The levels of βcatenin were markedly related to inflammatory corneal neovascularization in rat cornea after alkali burn.
KEYWORDS：βcatenin; vascular endothelial growth factor; cornea alkali burn;corneal neovascularization
0引言
角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是眼表及角膜病致盲的重要原因，CNV不仅使角膜透明度下降，影响视力，也是角膜移植术后发生排斥反应的高危因素[1,2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是主要的促血管生成因子之一，VEGF可刺激血管内皮细胞通透性改变，引起血管内皮细胞迁移和增殖。最近研究表明，Wnt通路的βcatenin能通过调节下游靶基因血管内皮生长因子的表达[3]，从而在肿瘤发生和炎症过程中参与新生血管形成。已有研究证实，眼部Wnt信号通路缺陷可对视网膜血管产生严重影响，并导致失明[4]。但其在角膜新生血管疾病中的作用，却很少有报道。基于βcatenin在血管形成中的重要作用及VEGF与CNV的关系，我们检测了CNV中βcatenin和VEGF的表达，从而进一步阐明CNV的机制，为研究CNV疾病的治疗方法探寻新的思路。
1材料和方法
1.1材料 成年SD大鼠25只，体质量200～250g，雌雄不限，健康无眼病，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，按角膜碱烧伤后1，4，7，14，21d随机分成5组，每组5只，右眼作为正常对照组，左眼作为实验组。
1.2方法 经100g/L水合氯醛(3mL/kg)全身麻醉后，用直径3mm滤纸浸入1mol/L氢氧化钠溶液1min，贴敷角膜中央20s，取下后用生理盐水冲洗结膜囊1min。右眼以生理盐水代替氢氧化钠作为正常对照组。碱烧伤后1d起，每日以裂隙灯显微镜检查CNV并计算CNV面积(A)：A=C/12× 3.1416[r2(rl)2][5]。A为CNV生长面积，C为CNV的跨圆周生长的钟点数，r为角膜半径，l为角膜新生血管从角膜缘深入角膜的长度。实验大鼠按角膜碱烧伤后1，4，7，14，21d断颈处死，取全角膜对半均分，一半40g/L多聚甲醛固定，一半充分匀浆研磨后置于trizol液中80℃保存，备免疫组化及逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)分析。
1.2.1 βcatenin活性的检测 βcatenin蛋白：常规免疫组化SP三步法，将固定后的角膜依次梯度乙醇脱水，二甲苯透明，56℃石蜡液浸蜡，石蜡包埋，连续切片后，按试剂盒说明书(购于武汉博士德，中国)进行免疫组织化学染色，阴性对照采用PBS代替一抗，方法步骤同上，光学显微镜下观察并照相。以HMIAS200高清晰度彩色医学图文分析系统检测各组灰度值，代表βcatenin各组的相对表达量。βcatenin mRNA：RTPCR检测βcatenin mRNA，trizol一步法提取总RNA(RTPCR试剂盒及PCR反应试剂购自武汉凌飞科技有限公司)，参照文献[6,7]设计引物，βcatenin上游引物5'GCTGACCTGACGGAGTTGGA3′，下游引物为5′GCTACTTGCTCTTGCGTGAA3′，产物长度为227bp。βactin上游引物为5′CTGGAAGGTGGACAGTGAG3′，下游引物为5′GAGGGAATTCGTGCGAGAC3′，产物长度为665bp。 取PCR产物电泳，以Sensi Anasys凝胶图像分析系统软件分别检测各组βcatenin及βactin积分吸光度值(A)，以βcatenin目的条带与βactin吸光度比值，即相对积分吸光度值(relative intergral absorbance,RIA)，代表各组βcatenin mRNA的相对表达量[8]。
1.2.2 VEGF活性的检测 常规免疫组化法检测VEGF，方法步骤同上。
统计学分析：采用SPSS 13.0软件进行方差分析，t检验及相关性分析。
2结果
2.1 CNV生长情况 角膜碱烧伤1d时仅见损伤区上皮水肿，角巩膜缘血管扩张充血;4d后可见角巩膜缘处有角膜新生血管芽呈毛刷状伸入透明角膜区;7d后CNV生长最为旺盛，显著变长，面积增加，血管伸出分支，部分吻合;14d后新生血管面积达到最大，交织成网状，其后CNV趋于稳定，无明显变化。
2.2角膜组织中VEGF表达 免疫组化显示正常角膜组织中无VEGF表达，碱烧伤后1d角膜基质层内即有大量炎性细胞浸润，4d后CNV管腔逐渐形成，基质层CNV管腔内皮细胞可见VEGF阳性染色(图1A, B)。图像分析结果示VEGF蛋白在伤后1d开始升高，4d达高峰，14d后开始回落，与对照组的表达量相比较，1，4，7d及14d组明显增高(图2)，差异有统计学意义(t1d=12.407，t4d=29.439，t7d=16.048，t14d=13.317，P<0.05);21d组增高不明显，差异无统计学意义(t21d=1.595，P>0.05)。
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