【摘要】 基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase9，MMP9）构成基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族中的明胶酶。MMP2，MMP9 作为MMPs家族分布最广的两种亚型，参与了多种眼科疾病的病理过程，如翼状胬肉、角膜炎、白内障、青光眼、增生性玻璃体视网膜疾病及黄斑变性等。我们就其结构、功能、在眼科疾病中作用以及研究的最新进展做一综述。
【关键词】 明胶酶MMP2和MMP9；组织抑制剂；眼科疾病
Gelatinase MMP2 and MMP9 and it’s tissue inhibitors in eye diseases JianShu Kang, WeiMin He Department of Ophthalmology, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China; Department of Ophthalmology, the Second Peoples Hospital of Yunnan, Kunming 650021, Yunnan Province, China Abstract Matrix metalloproteinase2（MMP2）and matrix metalloproteinase9（MMP9）which belong to the family of matrix metalloproteinases（MMPs） are Ca2+ and Zn+2 dependent endoproteinases. The two compose Gelatinas, one subfamily of MMPs, involve in the degradation of a wide variety of the extracellular matrix (ECM) components. The proteolytic activity of MMPs depend on the MMPs/TIMPs balance. MMP2 and MMP9, distributing more extensively than other MMPs, involved in many eye diseases, such as pterygium, keratitis, cataract, glaucoma, vitreoretinopathy, maculopathy et al. In this review, we mainly focus on the structure, functions and contributions of MMP2 and MMP9 in the eye diseases, highlighting recent research advance. KEYWORDS: gelatinase MMP2 and MMP9; tissue inhibitors; eye diseases0引言
基质金属蛋白酶是一组Zn2+和Ca2+依赖性内肽酶家族，目前确定了至少26 种MMPs 家族成员，按发现的先后顺序，分别命名为MMP1～26，根据这些酶的基本结构和主要作用底物的不同共分为5类，明胶酶是其中一个主要类型包括明胶酶A(MMP2)和明胶酶B(MMP9)，是目前研究比较多的两种基质金属蛋白酶。 1基质金属蛋白酶与基质金属蛋白酶抑制剂 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)其主要由成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及肿瘤细胞合成和分泌，广泛分布于人体各组织，并在某些组织中特异性表达[1]。MMPs能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrixc,ECM）成分，参与了分解多种细胞外基质和降解基底膜的生理和病理过程。另外，还可以作用于非基质蛋白，如细胞因子、受体及抗微生物肽等[2]，在胚胎发育、组织属性、细胞分化、炎症反应、细胞增生及凋亡等方面发挥了不可替代的作用。基质金属蛋白酶组织抑制剂( tissue inhibitors of matrix metelloproteinases,TIMPs)是MMPs的天然组织特异性抑制剂。以1∶1 的比例与MMPs形成复合体，从而阻断MMPs与底物结合。TIMPs家族主要有TIMP1，TIMP2，TIMP3，TIMP4。主要作用是调控MMPs局部表达及活性，此外，还具有生长因子样特性及调控细胞增殖与细胞凋亡等功能。
2基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的特性
MMP2和MMP9是MMPs家族分布最广的两种亚型，具有MMPs家族的一般特点及生物学功能，其结构在信号肽、前肽和催化区三个结构区域的基础上，还有胶原结合区(collagen bindingdomain,CBD)和血红素样区。人类MMP2基因编码分子量约72kDa的酶原，经活化后水解为65kDa的活性形式。MMP2的底物主要有Ⅰ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅶ，Ⅹ型胶原以及明胶、纤维连接蛋白、弹力蛋白、proMMP9等[3]。在基底膜降解、伤口愈合和组织修复中起非常重要的作用。MMP9又叫92kd明胶酶，是金属蛋白酶家族中分子量最大的酶。MMP9第9外显子中的136个氨基酸碱基序列和MMP2的第9外显子是同源的，但与其他MMPs不同的是，MMP9基因中有48个碱基序列是其它金属蛋白酶所没有的。其底物主要有Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ型胶原以及明胶、纤维连接蛋白、弹力蛋白、蛋白聚糖等[3]。在细胞分化、组织损伤、修复中发挥重要作用。在生理状态下，组织中MMP2，MMP9表达量极少，炎性细胞因子、激素、生长因子等可改变其转录水平，另外酶原的激活、介质中各种因子的作用，以及抑制剂等都可影响其在组织中的最终活性含量。TIMPs通常被认为是MMPs的抑制剂，如TIMP2和TIMP1能分别与MMP2酶原和MMP9酶原结合，从而抑制其活性[3]。在实验条件下，TIMP1 和TIMP2 可抑制肿瘤生长、浸润和转移[4]。但TIMPs也有激活作用，如TIMP2通过MMP14的介导而激活MMP2 [5]。
3基质金属蛋白酶2，基质金属蛋白酶9与眼科疾病
3.1结膜疾病 弹性纤维与胶原纤维增生和变性是翼状胬肉的主要病理改变，MMP2，MMP9主要在结膜成纤维细胞中表达，在胬肉中表达显著提高，在Bowman层见MMP2表达，胬肉眼泪液中的MMP9含量是正常的2倍[6]。沙眼病程后期，结膜瘢痕形成，患眼结膜中发现MMP9的活性增高，释放MMP9的炎细胞增多，提示此酶参与结膜ECM的降解及瘢痕形成。
3.2巩膜疾病 巩膜炎的基本病理特征是巩膜基质的退行性改变。Di Girolam等[7]将培养的坏死性巩膜炎的巩膜成纤维细胞用IL1α和TNFα刺激后，发现TIMP1mRNA 表达提高1倍，MMP9 表达明显，这为MMPs/TIMPs失衡导致巩膜组织破坏机制的假设提供了证据。巩膜是近视作用下的靶组织。在近视眼后部巩膜可见ECM的改变，MMP2和MMP9能够降解巩膜成分中最多的天然Ⅰ型胶原。在动物近视模型中证实，MMP2，MMP9活性增加而TIMP活性降低，可能是导致巩膜近视改变的重要原因。Jones等[8]在树鼠形觉剥夺眼中发现赤道部和后极部巩膜MMP2的活性显著增加，而在对照眼MMP2大部分以非活性形式存在。Kenning等[9]的研究再次证明了巩膜MMP2表达水平与近视发生的相关关系。多项研究都说明 MMPs与其抑制物之间的失衡是导致ECM产生和降解失衡、巩膜重新塑形的关键因素[10]。
3.3角膜疾病 角膜基质中主要含有Ⅰ型胶原，另有少量Ⅲ，Ⅴ型胶原等，上皮基底膜主要成分为Ⅳ型胶原。在一些角膜疾病，如碱烧伤、炎症、移植排斥等可出现MMP2和MMP9的水平增高，导致角膜结构的破坏和崩解，其中MMPs可能起主要作用[11]。有实验在角膜热烧伤标本中发现MMP2阳性染色部位主要在角膜上皮细胞层和基质层，MMP9 阳性染色部位主要见于上皮层和基底膜，并与角膜基质的降解程度呈正相关[12]，推断二者参与角膜基质的降解丢失；1969 年Brown 等提出碱烧伤后角膜溃疡很大程度上是蛋白水解酶降解角膜细胞外基质的结果。在角膜碱烧伤后基质层出现新生血管，研究认为MMP9通过破坏细胞外的基质促进了新生血管的生长[13]。糖尿病病变角膜上皮和基质中也有MMPs家族成员的表达增加，Takahashi等[14]在糖尿病大鼠损伤的角膜上皮细胞中发现包括MMP2，MMP9在内的MMPs活性升高。在类风湿性关节炎并活动性眼部疾病、周边溃疡性角膜炎、圆锥角膜、系统性和非系统性干眼症泪液中均有明胶酶存在，且主要来源于中性粒细胞[15]。Solomon 等[16]发现MMP9在酒渣鼻致睑板腺病变和Sjgrens综合征中活性明显增加。 TIMP1可促进上皮愈合重建，并抑制上皮源性MMP9。Paterson等[17]发现家兔角膜碱烧伤后，接受TIMP1 治疗的角膜溃疡的发展比单独应用赋形剂的治疗者要明显减轻，由此推断TIMP1在抑制角膜溃疡的发生发展中可能起着重要的作用。羊膜移植在角膜碱烧伤的治疗中有较好的疗效，与羊膜可能抑制MMP9在角膜上皮及多形核白细胞中的表达有关[18]，同时羊膜促使TIMP1后期表达水平升高。因此，通过基质金属蛋白酶抑制剂降低MMPs的活性可能是治疗角膜疾病的一个有效途径。MMPs抑制剂，如组织金属蛋白酶抑制剂、四环素、转化生长因子β合成的基质金属蛋白酶抑制剂等，对各种角膜疾病均有治疗作用。目前研究较多的GM6001，其作用机制可能为通过与MMPs活性位点上的Zn2+结合，而抑制酶的活化。
3.4白内障 晶状体囊是一层包绕整个晶状体、具有弹性的透明基底膜，由胶原网状结构组成，其中的主要成份IV型胶原蛋白和层黏连蛋白。正常晶状体前囊无MMPs、TIMPs表达。ECM的聚集及异常降解与糖性白内障晶状体前后囊膜下纤维化有关。徐国兴等[19]在糖尿病性白内障患者的晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)中发现MMP2的阳性表达率与正常人有显著差异，而TIMP2的阳性率与正常人比较，差异无显著意义。Tarniya等[20]利用酶谱分析法在H2O2存在的猪晶状体培养基中发现了MMP2 和MMP9 的过量表达，而在正常猪晶状体培养基中未测到。由此猜测MMP2和MMP9引起的明胶分解活动在白内障的形成中起作用。Wormstone 等[21]对后发性白内障混浊的后囊进行培养，发现有MMP2，MMP9 的释放，且TGFβ2 可增加其释放。白内障术后不同时期TIMPs和MMPs的表达则存在明显的差异。MMP2的表达水平增高，而TIMP2的表达水平未能相应增高，两者的比例失衡导致ECM中的Ⅳ型胶原和层黏连蛋白等降解增多，使正常ECM组成成分发生改变，导致晶状体后囊膜的混浊和纤维化，最终诱发囊膜下型白内障的形成。生理状态下房水中的MMPs和TIMPs可来源于血液，部分来源于角膜、睫状体和小梁等周围组织细胞。术后晶状体上皮细胞异常表达MMP1，MMP2，MMP9和TIMP1，在这些因素的共同作用下，Ⅳ型胶原蛋白和层黏连蛋白的合成和降解失衡，晶状囊膜的正常组织结构和功能遭到破坏，通透性发生改变，最终导致混浊[22]。
3.5青光眼 小梁细胞和睫状肌细胞内均存在丰富的细胞外基质，ECM既起到了支架作用，又维持了部分房水的流出。在培养的人睫状肌细胞中，发现MMP1，MMP2，MMP3，MMP9的表达。在人眼小梁细胞中也发现MMP1，MMP2，MMP3，MMP9及TIMP1，TIMP2的表达。MMPs上调则ECM减少，下调则ECM堆积，小梁网内异常ECM堆积是原发性青光眼和激素性青光眼的病理表现，糖皮质激素可以抑制小梁细胞MMP3，MMP9的表达可能是激素性青光眼的病因之一[23]。青光眼视神经病变的特征为ECM改变和视盘神经节细胞轴突丧失。Yuan等[24]的研究表明：青光眼视盘小胶质细胞炎症因子表达增加，视盘血管旁小胶质细胞包括MMP2在内的多种的MMPs 表达明显增强。在体内和体外实验中，青光眼组筋膜囊的成纤维细胞MMP9的低表达可能导致了开角型青光眼患者结膜下胶原增生和结膜瘢痕形成[25]。
3.6葡萄膜炎 正常人的房水中不能检测到MMP9表达，葡萄膜炎中MMP9 受炎症介质、细胞因子的调节[26]。ElShabrawi 等[27]通过对16例葡萄膜炎患者的房水研究发现，所有患者的房水中均存在MMP2，MMP9，且二者表达量的多少与葡萄膜炎的严重程度呈正相关，在4例慢性葡萄膜炎患者房水中也检测到MMP2，MMP9 表达，活动期二者表达明显增强，且房水中IL1β，IL12水平与MMP2，MMP9表达量相关。TIMP2可抑制MMP2的活性，从而减轻炎症。TIMP1通过抑制MMP9的活性减少组织损伤，二者之间的平衡是引起眼组织损伤和修复的关键所在。有报道在炎症开始后7～21d，皮下注射合成的MMP抑制剂，可延缓疾病的发展[28]。因此，利用外源性组织型或人工合成抑制剂抑制MMP2,MMP9的活性，可能在葡萄膜炎治疗中起重要作用，但对MMPs和TIMPs的激活和抑制机制以及如何调节二者之间的平衡，尚需进一步研究。
3.7玻璃体液化和后脱离 玻璃体后皮质借一些细胞基质成分如:纤连蛋白、层连蛋白、蛋白聚糖与视网膜内界膜Ⅳ型纤维附着。MMP2 能降解纤维连接蛋白、Ⅳ，Ⅴ型胶原以及变性的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型胶原和糖蛋白，保证一些明胶和受损的胶原被及时清除，保持玻璃体黏性胶样状态和正常的生理功能，MMP9能降解Ⅳ，Ⅴ胶原和基底膜成分，有利于视网膜上皮细胞和炎症细胞的浸润和迁移。VaughanThomas 等[29]分析尸体眼玻璃体MMPs的含量，发现“正常”玻璃体内含有MMP2和MMP9酶原，随着年龄增加，玻璃体内MMP2酶原和MMP9酶原量无变化，但纤溶酶量增加，可激活MMPs，分解胶原、液化玻璃体，同时可能分解玻璃体与内界膜粘连致后脱离。因此推测MMP2的活性水平升高反映玻璃体的生理功能异常；而MMP9含量升高从一定程度上反映了眼内炎症的严重程度和伤口愈合反应。
3.8增生性玻璃体视网膜病变和孔源性视网膜脱离 增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)的基本病理过程是细胞的迁移、增生和收缩。ECM对细胞的迁移、增生、黏附、分化和基因表达有复杂的调控作用，与PVR的形成关系密切。Kon等[30]分析了行玻璃体视网膜手术的140例患者，结果在玻璃体内发现两种MMPs，分别是MMP2，MMP9，它们与术前PVR无明显相关性，但与术后PVR的形成关系密切，推论这两种MMP的激活可能是术后PVR发生的危险因素。王桂云等[31]也在孔源性视网膜脱离患者血清及视网膜下液中检测到MMP2，MMP9高表达，这可能与玻璃体液化和变性有关，或者来源于视网膜血管系统，当发生孔源性视网膜脱离时，被激活的细胞可能会增加MMP2分泌。
3.9糖尿病视网膜病变 增生性糖尿病视网膜病变( proliferative diabeticretinopathy, PDR)，组织缺氧刺激血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，引起血管壁渗漏及内皮细胞增生迁移，形成纤维血管。已有研究表明，MMP2和MMP9与新生血管形成密切相关[32]。PDR 发生玻璃体积血的患者，玻璃体腔内MMP9表达水平显著升高[33]。刘东宁等[34]检测20例PDR患者视网膜前纤维血管膜MMP2与MMP9的表达，结果发现PDR增殖膜细胞染色阳性率分别为70%和85%，而正常视网膜标本MMP2和MMP9染色均为阴性。还有实验[35]观察苍鼠糖尿病模型视网膜中MMP2mRNA 表达情况，证实MMP2参与了早期糖尿病模型视网膜结构的重塑，对新生血管的发生可能有重要作用。PDR中MMPs表达随病程进展升高，这可能是由于视网膜毛细血管大量狭窄闭塞及功能异常，视网膜缺血缺氧，血管内皮细胞在局部释放细胞因子(如TNFα, IL1 )和血管活性物质(如VEGF)诱导了MMPs的表达升高。综上，MMPs与VEGF在PDR病理过程中起了协同作用。
3.10年龄相关性黄斑变性 在年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)中，玻璃膜ECM异常降解重建、内皮细胞增殖、迁移，黄斑区脉络膜新生血管膜( choroidal neovascularization, CNV)形成。这些改变与脉络膜和玻璃膜上的MMPs和TIMPs水平失衡密切相关。分布于玻璃膜和脉络膜基质中的MMP2,MMP9，在新生血管的形成中，起了重要作用。Lambert等[36]研究CNV动物模型，发现MMP2和MMP9基因联合表达缺失的小鼠，CNV产生明显少于MMP2，MMP9各自基因表达缺失的小鼠，证明了MMP2，MMP9联合作用对于CNV产生的重要性。此外，玻璃膜上还有TIMP2存在，因此推测玻璃膜疣中高浓度的TIMPs抑制了MMPs表达，致蛋白酶溶解活性下降导致玻璃膜上ECM合成降解失调[37]，使玻璃膜增厚，ECM异常沉积在玻璃膜上。Stetler Stevenson等[38]发现TIMP2是CNV抑制剂，可抑制生长因子刺激的人微血管内皮细胞增生，TIMP2抑制CNV机制可能也在于此。也有报道[39]钙调节剂可抑制MMP2的产生，最终抑制脉络膜血管内皮细胞的增生。以上表明，MMPs，TIMPs在玻璃体视网膜病变中视网膜ECM的破坏、新生血管生成等过程中发挥了重要作用。TIMPs起着重要的抗新生血管作用，这为AMD的防治提供了新的研究角度。
3.11眼科肿瘤 视网膜母细胞瘤(retino blastoma, RB)是婴幼儿最常见的、危害性最大的眼内恶性肿瘤，龙华等[40]检测41例RB组织切片中MMP2，MMP9的表达，发现二者表达水平高于正常组，且与RB的临床分期和视神经浸润有密切关系。另一项对32例RB的实验研究也发现MMP9，TIMP1的阳性表达率有统计学差异[41]。在动物实验中，也发现RB肿瘤细胞MMP2，MMP9染色阳性，而几乎所有的细胞TIMP1，TIMP2染色呈阴性[42]。另外，MMP2，MMP9在脉络膜黑色素瘤中的表达也存在明显的正相关关系[43]。
综上所述，MMP2和MMP9 及其TIMPs在眼科多种疾病的形成和发展中发挥了重要作用，MMP/TIMP系统靶向干预已取得一定的进展，对MMP2，MMP9与TIMP的平衡关系及作用机制有待于进一步研究，以便于更好地应用于眼科疾病的预防和治疗。
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