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【关键词】 色素上皮，眼 细胞，培养的 柔红霉素/药理学 细胞死亡 显微镜检查，电子
柔红霉素(daunoblastina)等抗代谢药物已广泛用于眼内细胞增生的防治研究，但多集中在药物抗增生方面[1]。我们从细胞死亡的角度 观察了柔红霉素对培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞的影响，以探讨药物的作用机制。
1 材料与方法
1.1 人RPE细胞培养 眼球来源、RPE细胞分离和原代培养方法同文献[2]，所用主要试剂有Delbecco改良的Eagle培养基(Delbeccos modified Eagles medium，DMEM)、干粉(Gibco产品)、胰蛋白酶(Difco进口分装)和小牛血清(杭州四季青生物制品厂产品)等。原代细胞接近铺满时进行1∶2～3传代，用含10%小牛血清的DMEM培养液于37℃、5%CO2培养箱培养。本实验选用第3～5代的RPE细胞。
1.2 药物浓度筛选 将RPE细胞以细胞密度为5×104/ml接种于24孔塑料培养板，每孔1ml。培养24小时，将培养液换成含10%小牛血清的DMEM液，根据分组分别加入柔红霉素(意大利爱宝大产品)的浓度为0(空白对照)、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00μg/L，每个浓度设3孔。培养12小时后，更换成不含药物的培养液继续培养24小时。消化收集细胞，0.4%台盼蓝染色，用血球计数板计数拒染细胞。上述实验重复2次。以药物浓度为横坐标，以空白对照组平均细胞数与每组平均细胞数的差值占空白对照组平均细胞数的百分比为纵坐标绘制量效曲线，以推算药物90%有效抑制浓度(EC90)。
1.3 柔红霉素处理RPE细胞 选EC90作实验浓度，作用于近铺满期RPE细胞，12小时后撤药，继续培养24小时后用于电镜观察。同时设立正常对照组。
1.4 透射电镜标本制备及观察 消化收集细胞，3.5%戊二醛、于4℃固定2小时以上。常规脱水、浸透、包埋、超薄切片和铅-铀双重染色，JEM-2000EX透射电镜观察和照相。同时在各组标本切片中连续计数50个细胞，计算各型细胞比例。重复3次，取平均值行χ2检验。
2 结果
2.1 药物剂量效应 随柔红霉素浓度增加，抑制率增高，培养人RPE细胞数目逐渐减少。本实验条件下，柔红霉素作用RPE细胞的EC90约为180μg/L。
2.2 透射电镜观察 ①正常RPE细胞：细胞呈圆形或椭圆形，直径约10～30μm，细胞周围可见大量微绒毛，胞膜完整。核膜双层结构清楚，有1～3个核仁。染色较深的小块状异染色质主要分布于核膜内侧及核仁周围，常染色质位于核中央，染色浅。胞浆内线粒体、内质网及高尔基体等细胞器丰富，偶见黑色素粒。②实验组RPE细胞：在固定的细胞中，30.7%的RPE细胞具有死亡形态，其中分两型：Ⅰ型细胞(占细胞总数的8.7%)早期胞膜局部破坏，胞浆内空泡形成，染色质凝集成块，与核膜分离，核膜结构不完整;后期胞膜消失，细胞器变性，结构无法辨认;核内结构溶解，残留少许粗颗粒状的染色质。Ⅱ型细胞占细胞总数的22.0%，较Ⅰ型细胞多见，早期胞浆和胞核轻度皱缩，在致密的胞浆中可以辨认线粒体等细胞器，染色质边集(margination)，呈新月形或驼峰状;中期细胞周围微绒毛减少或消失，胞膜及其内侧空泡形成，胞体进一步皱缩，细胞体积变小，呈三角形或多角形，胞浆仅呈围绕胞核的一个极窄间隙，胞核更加致密，但仍可见完整的核膜结构及边集的染色质，有的胞核呈分叶状，线粒体基本正常或轻度肿胀;晚期偶见个别细胞凝集的染色质成片段状，核膜破裂，细胞器及胞膜自溶。③对照组RPE细胞：94.7%的细胞形态正常，偶见Ⅰ型细胞(5.3%)，未见典型的Ⅱ型细胞。死亡细胞明显少于实验组(P<0.01)。
3 讨论
细胞死亡可分为坏死(necrosis)和凋亡(apoptosis)两种。前者是严重损伤刺激造成的一种病理变化，后者是由来自细胞本身或细胞外的死亡信号触发的一个级联式基因表达的结果。细胞凋亡和增生的相互平衡控制着真核多细胞生物细胞数目的稳定[3]。近年来研究证实，抗代谢药物既能抑制瘤细胞的增生，也可促进其死亡，而凋亡是其中一种主要的死亡方式[4，5]。坏死和凋亡具有完全不同的形态特征[4，6]。发生坏死时，细胞肿大、胞浆和胞核溶解;胞内物质溢出，导致周围组织发生炎症。细胞凋亡则表现为细胞皱缩、染色质凝集、片段化，最终形成凋亡小体(apoptotic body)，不伴炎症反应。形态学观察是判定凋亡最客观的方法之一[7]。
在本研究中我们观察到，柔红霉素作用于培养的人RPE细胞后至少出现2种死亡形态。Ⅰ型细胞表现为胞浆和胞核的进行性溶解，与传统的细胞坏死相符。Ⅱ型细胞的主要特征为胞浆和胞核的皱缩，染色质边集，胞膜和核膜完整;晚期核碎裂，符合凋亡的形态特征。柔红霉素是一种蒽环类抗代谢药物，它可以引发肿瘤细胞的凋亡[8]。以往的实验证实，柔红霉素可以干扰DNA和RNA的合成，抑制眼内细胞的增生[1]。本研究结果提示，柔红霉素可引发培养的人RPE细胞凋亡。通过激活核酸内切酶，使DNA降解，表现为染色质的凝集和边集;由于细胞内液选择性丧失，细胞皱缩，胞质和胞核致密;核分叶和染色质片段化现象，可能是凋亡小体的前期改变;个别染色质破碎的细胞胞膜破裂可能是细胞自溶的结果。本研究未观察到凋亡小体，可能与其数量少和存留时间短(数小时)有关。
我们的观察结果提示，只要条件适宜，抗代谢药物不但可以抑制核酸合成或细胞有丝分裂，还可引发RPE细胞凋亡。新近国外报道，Hypercin和Fas/APO-1可分别诱发和介导RPE细胞凋亡[9，10]，同样说明RPE具有发生凋亡的能力。因此设想，通过外界因素的调控，促进或阻遏RPE细胞凋亡，将可能成为防治眼内增生性疾病和视网膜变性疾病的一个新方向。
本课题受国家自然科学基金资助，基金号39700154;本文为第一届世界华人眼科大会优秀青年论文奖部分内容
作者单位：710032西安，第四军医大学西京医院眼科 |
