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应用PCR技术诊断单疱病毒性角膜炎

http://www.cnophol.com 2008-10-28 16:23:59 中华眼科在线

  摘 要:目的 探讨PCR对HSK的诊断价值。方法 应用PCR技术对临床诊断活动期HSK 33眼匐行性角膜溃疡5眼,原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测。结果 活动期HSK具有上皮病变者30眼中24眼检出HSV-1 DNA,5眼匐形性角膜溃疡全部未检出HSV-1 DNA;5眼原因不明角膜炎中1眼检出HSV-1 DNA。结论 PCR是一种快速、灵敏、特异性强的方法,对角膜炎的早期诊断及鉴别诊断具有重要意义,具有高度的临床应用价值,值得推广。

PCR in diagnosis of HSK

LIN Guo-Cai,CHEN Chao-Han

  (Department of Ophthalmology,First Hospital of Longyan City,Longyan 364000,Fujian Province,China)

  Abstract:Objective To investigate the value of polymerase chain reaction(PCR) in the diagnosis of herpes simpler keratitis(HSK).Methods PCR was used to detect herpes simplex virus type 1(HSV-1)DNA in 33 eyes with active HSK,5 eyes with serpiginous corneal ulcer and 5 eyes with keratitis with unknown cause.Results The results showed that 24 of 30 eyes with active HSK with epithelial lesions were positive for HSV-1 DNA.None of the five serpiginous corneal ulcers were positive.Of the five keratitis with unknown causes,one was positive.Conclusion PCR is a rapid,sensitive and specific diagnostic technique.It plays an important role in the early diagnosis and differential diagnosis for various keratitis.Its value should be highlighted.

  Key words:HSK;HSV-1;PCR▲

  单疱病毒性角膜炎(HSK)是目前眼部病毒感染中发病率最高的疾病,据国内最新统计,它已是角膜病的首要致盲原因[1-3]。其特点是急性感染后进入稳定期,在一定条件下可复发。其反复发作、迁延不愈以及抵抗药物治疗等特点,使眼科医生甚感棘手。近年由于激素及抗病毒剂的广泛应用,致使病变形态不典型,给临床诊断造成困难。我科自1994年起采用PCR技术对临床诊断为活动期HSK 33眼,匐行性角膜溃疡5眼,原因不明角膜炎5眼进行HSV-1 DNA检测,现将结果报告如下。

  1 材料与方法

  1.1 材料

  1.1.1 标本收集 以5g·L-1地卡因表麻,用尖刀片刮取角膜病变处上皮组织少许,立即置于男性拭子管内送检,其中临床诊断树枝状角膜炎24眼,地图状角膜溃疡5眼,盘状角膜炎4眼,匐行性角膜溃疡5眼,原因未明角膜炎5眼。

  1.1.2 检测试剂 由厦门泰伦生物工程有限公司提供的单纯疱疹病毒DNA PCR试剂盒,其扩增产物227bp。

  1.2 方法

  1.2.1 样品提取 (1)将角膜刮取组织悬于0.5mL无菌生理盐水。取200μl样品悬液,加入0.5mL离心管中,滴加6滴裂解液彻底混匀,置室温作用10min,每分钟4 000转离心2min,弃上清;(2)加8滴洗涤液,混匀,照上法离心,弃上清凉干;(3)加二滴溶解液,充分混匀,置室温(最好55℃水浴)作用10min,上清液即可作PCR检测。

  1.2.2 PCR扩增加20μL模板上清加入反应管,混匀,稍许离心,即可上机。先94℃预变性5min,按照94℃30s、58℃30s、72℃60s的条件,反复扩增35个循环,最后72℃延伸5min。

  1.2.3 将浓缩缓冲液10mL稀释到500mL,取25mL于烧杯中,加入琼脂糖,加热使之溶解,浇制电泳平板,剩余缓冲液作电极液。取10μL PCR反应终产物,直接点样,电泳100V,10~20min,于紫外透射仪观察结果,阳性者可见一条与阳性对照平行的扩增条带。

  2 结果

  2.1 树枝状角膜炎24眼中PCR检测法20眼HSV-1 DNA阳性,阳性率83.3%;地图型角膜炎5眼中,3眼阳性,阳性率60%;盘状角膜炎4眼中,1眼阳性(为合并上皮病变者),阳性率25%.匐行性角膜溃疡5眼,PCR法检测HSV-1 DNA全部阴性。5眼原因不明角膜炎,PCR法检测1眼HSV-1 DNA阳性。

  3 讨论

  病毒分离是经典的病原学特异诊断方法,由于组织培养费时费力,不能提供早期诊断,且基层医院不能普遍开展,目前临床诊断主要通过病史及裂隙灯检查来完成。近年来由于激素和免疫抑制剂的广泛应用,使HSK发病率不断上升,同时由于HSK病情迁延,复发率高,病变形态多种多样,病变表现常不典型,故临床上仅凭病变形态进行诊断,易造成误诊误治,贻误病情。

  从以上检测结果可以看出,有上皮病变者HSV-1检出率高达80%,检出率高,表明PCR法检测灵敏度高。深层角膜炎无合并上皮病变者3例均未检出HSV-1,除可能这些病变不是HSV-1所致外,更可能是因病变部位深,角膜上皮尚未受病毒感染所致。典型树状角膜炎24眼中有4眼未检出HSV-1,表明并非树枝状病灶均为HSK,临床仅凭病变形态进行诊断容易误诊。1例原因不明角膜炎检出HSV-1 DNA,说明了HSV-1眼部感染的不典型性。5眼匐行性角膜溃疡PCR法检测HSV-1 DNA均阴性,提示应用PCR技术检测HSV-1 DNA不仅灵敏度高,而且特异性强,在临床应用方面具有鉴别诊断意义。

  PCR法是检测病毒基因,影响因素很小[4],且基因水平上诊断具有高度的特异性,从理论上讲,只要存在一个DNA分子,就可用PCR法检出[4],因而具有高度的敏感性。此外,PCR法检测角膜组织HSV-1,取材方便,只要少量角膜上皮,同时检测时间短,仅需6~7h,且操作简便,再加上其实验设备要求不高等优点,因而具有高度的临床应用价值,值得推广应用。

  参考文献:

  [1]姜忠良.单疱病毒性角膜炎的分子生物学研究进展[J].国外医学眼科学分册 1997;21(2)∶109-114.

  [2]杜 鹃.多聚酶链反应对单疱病毒性角膜炎泪液HSV-DNA的检测[J].中国实用眼科杂志 1998;16(2)∶98-99.

  [3]吴一迪.单疱性角膜炎病毒基因诊断研究[J].中国实用眼科杂志 1998;16(3)∶139-140.

  [4]管怀进.聚合酶链反应检测角膜组织中的单疱病毒DNA[J].中国实用眼科杂志 1995;13(6)∶352-355.

(来源:眼科新进展 2000年第1期第20卷)(责编:duzhanhui)

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