眼科研究 2000年第3期第18卷 实验研究

作者：曹阳　魏厚仁　富名水　麦才铿　丁正平　吕源淑　张缨

单位：430022　武汉，同济医科大学附属协和医院眼科

关键词：小梁网；细胞；培养的；转化生长因子；受体；转化生长因子；青光眼；开角型

　　摘要　目的　从蛋白质水平了解体外培养牛眼小梁细胞是否表达转化生长因子β(TGF-β)及其受体(TGF-βR)。方法　采用Supervision法对体外培养第3代牛眼小梁细胞进行TGF-β₁，TGF-βR免疫组化检测。结果　小梁细胞TGF-β，－β₂和TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ免疫组化染色的阳性信号分别位于胞浆内和胞膜上，阴性对照未见阳性信号。结论　牛眼小梁细胞表达TGF-β，TGF-βR蛋白。较之猪眼小梁细胞，牛眼小梁细胞更适用于今后研究TGF-β及其受体与原发开角型青光眼发病学的关系。

　　分类号　R775

Expression of TGF-β and TGF-β receptors protein in cultured bovine trabecular meshwork cells

Cao Yang，Wei Houren，Fu Mingshui

　　（Department of Ophthalmology，Union Hospital，Tongji Medical University，Wuhan 430022）

　　Abstract　Objective　To study whether cultured bovine trabecular meshwork cells express transforming growth factor-β(TGF-β) and TGF-β receptors(TGF-βR） in protein level．Methods　Bovine trabecular meshwork cells were cultured in vitro and passaged 3 times，then the cells were transfered or cultured onto sterile cover lips，and the expressions of TGF-β and TGF-βR were detected with immunohistochemical technique-Supervision method．Results　TGF-β₁，-β₂were significantly expressed in the cytoplasm of cultured bovine trabecular meshwork cells，and TGF-βR Ⅰ，RⅡ，RⅢ immunostain were positive on the membrane of the cells．No immunostaining was seen in the negative control．Conclusion　The presence of TGF-β and TGF-βR in cultured bovine trabecular cells were confirmed．Bovine trabecular cells may be more suitable to investigate the relationship between TGF-β，TGF-βR and primary open-angle glaucoma than porcine trabecular cells．

　　Key words　trabecular meshwork cell，cultured transforming growth factor receptor，transforming growth factor glaucoma，open-angle

　　原发开角型青光眼(primary　open-angle　glaucoma，POAG)是常见致盲性疾病之一。小梁细胞数目异常减少，细胞外基质异常沉积是其主要病理改变^［1，2］。有研究表明，具有抑制小梁细胞生长^［3，4］、促其细胞外基质合成^［5，6］等作用的转化生长因子-β(transforming　growth　factor-β，TGF-β)在POAG患者房水中的浓度明显高于正常人，可能参与了POAG的发生^［7］。本实验拟对体外培养牛眼小梁细胞TGF-β及转化生长因子β受体(transforming　growth　factor-β　receptors，TGF-βR)进行免疫组化研究，以利于进一步研究TGF-β及其受体与POAG发病学的关系。

　　1　材料和方法

　　1．1　牛眼小梁细胞体外培养和鉴定参见我科过去报道的方法^［8］

　　1．2　制作细胞爬片

　　取第3代近融合小梁细胞，消化后传入预置消毒盖玻片的培养皿内，置37℃CO₂培养箱中培养至细胞生长近融合。取出盖玻片，用PBS充分浸洗，冷丙酮固定30min后，晾干。

　　1．3　制作细胞涂片

　　第3代小梁细胞消化后制成细胞悬液，滴在消毒盖玻片上，自然干燥后，冷丙酮固定，晾干待用。

　　1．4　免疫组化染色(Supervision法)

　　将细胞爬片和细胞涂片放入0.5%H₂O₂中30min，以消除内源性过氧化酶活性。蒸馏水洗3次，滴加山羊血清封闭液，室温下10min，以封闭非特异性抗源。甩去山羊血清，分别滴加兔抗人、大鼠、小鼠TGF-β₁，-β₂和TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ单克隆抗体(美国Sigma公司产品)，4℃湿盒中过夜。第2天取出后用PBS洗3次，滴加Supervision过氧化物酶-山羊抗兔IgG(武汉Boster公司产品)，置37℃湿盒中30min，PBS洗4次，DAB显色，显微镜下观察至出现棕黄色阳性信号，水洗终止反应。苏木素轻度复染。梯度酒精脱水，二甲苯透明，光学树脂封片，镜下观察拍照。阴性对照以PBS代替第1，2抗体，阳性对照分别选用皮肤和乳腺癌标本。

　　2　结果

　　牛眼小梁细胞TGF-β及TGF-βR免疫组化染色呈阳性，其中TGF-β₁，-β₂棕黄色阳性信号位于细胞浆内，而TGF-βRⅠ，RⅡ，RⅢ的阳性信号位于细胞膜上，阴性对照未见阳性信号(图1～6)。

图1　免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-β₁染色阳性(×200)　图2　免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-β₂染色阳性(×100)　图3　免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅠ染色阳性(×200)　图4　免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅡ染色阳性(×200)　图5　免疫组化Supervision法，小梁细胞TGF-βRⅢ染色阳性(×100)　图6　免疫组化Supervision法，小梁细胞阴性对照（×100）　Fig．1　Trabecular　cells　presented　positive　reactions　to　TGF-β₁　with　Supervision　immunohistochemical　stain　（×200)　Fig．2　Trabecular　cells　presented　positive　reactions　to　TGF-β₂　with　Supervision　immunohistochemical　stain　（×100)　Fig．3　Trabecular　cells　presented　positive　reactions　to　TGF-βRⅠ　with　Supervision　immunohistochemical　stain　（×200)　Fig．4　Trabecular　cells　presented　positive　reactions　to　TGF-β　R　Ⅱ　with　Supervision　immunohistochemical　stain　（×200）　Fig．5　Trabecular　cells　presented　positive　reactions　to　TGF-β RⅢ　with　Supervision　immunohistochemical　stain　（×100)　Fig．6　Negative　control　of　trabecular　cells　with　Supervision　immunohistochemical　stain (×100)

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