【摘要】 目的：探索遗传性视网膜病变模式大鼠的氧诱导视网膜新生血管特点。方法： 将新生（生后7d）的SD大鼠、CSNB大鼠和RCD大鼠各1窝每窝（即每组）6只暴露于800±20mL/L氧浓度环境中持续饲养5d，然后再回到正常氧环境条件饲养5d；对照组为以上3种品系同龄新生鼠各1窝，每窝（即每组）各6只置于正常氧环境中饲养17d作为对照。在第18d时将所有幼鼠行心脏墨汁灌注，取出两侧眼球，其中1眼用于视网膜铺片了解视网膜血管形态的改变，另1眼用于组织切片观察并统计突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核的数目。结果：在正常饲养环境下，RCD大鼠视网膜血管网稀疏，SD大鼠CSNB大鼠视网膜血管未见明显异常。在氧诱导下，各实验组大鼠视网膜血管正常网络状结构受到破坏，结构稀疏，血管迂曲、收缩或扩张，部分血管出现闭塞，其中SD大鼠、CSNB大鼠视网膜有出血点，甚至片状出血。组织切片显示对照组的SD大鼠中偶见突破内界膜的内皮细胞核，其他两组均未见。实验组中SD大鼠、CSNB大鼠和RCD大鼠3种品系中均可见较多的突破内界膜内皮细胞核，计数结果分别为24.10±2.49，38.20±10.47，68.00±3.06，与同品系的对照组有显著性的差异（P<0.01）；与不同品系的实验组比较也均有显著性差异（P<0.01）。结论： 氧诱导的新生大鼠视网膜新生血管与品系有关，视网膜退行性病变大鼠仍可诱导出视网膜新生血管，且严重程度可能与感光细胞的功能有关。
【关键词】 视网膜退行性病变 视网膜新生血管 大鼠
0引言
视网膜新生血管增生是一类常见的致盲性疾病，如早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等疾病均可因新生血管增生而形成牵拉性视网膜脱离。视网膜新生血管的发生原因仍不十分清楚，是眼科关注的重点问题之一。视网膜缺血缺氧是导致视网膜新生血管的重要原因，缺氧诱导视网膜新生血管生成是常用的复制视网膜新生血管性疾病，特别是研究早产儿视网膜病变的方法[1，2]。但是缺氧诱导的视网膜新生血管形成与所采用的动物品系有关。另外有文献报道，视网膜色素变性患者及视网膜退行性变模式小鼠很少生成新生血管，为新生血管疾病的治疗带来了新的希望[3]。我们发现，两种自发性基因突变模式大鼠，分别为先天性静止性夜盲（congenital stationary nightblindness,CSNB）大鼠[4]和视网膜锥体细胞变性（retinal cone dystfunction,RCD）大鼠[5]，其在成年时仅主要表现为功能性的改变，而视网膜光感受器则无明显的退行性变化。为进一步探索视网膜新生血管的发生机制，我们参照文献[6]方法，对新生大鼠采用高浓度氧诱导视网膜新生血管制备模型，观察两种模式大鼠的视网膜新生血管发生特点。
1材料和方法
1.1材料
选择清洁级、鼠龄为7d的SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠各1窝每窝（即每组）6只为高氧/复氧实验组，正常对照组为以上3种品系同龄新生鼠各1窝每窝（即每组）6只。（正常SD大鼠由第四军医大学实验动物中心购买，突变品系动物由第四军医大学航空航天医学系屏障动物实验室提供）。将实验组新生鼠与代乳母鼠共同置于密闭的高压氧动物舱。氧舱内接入医用纯氧，氧气的流量控制在0.5～0.75L/min，使氧舱内氧浓度保持在800±20mL/L，氧舱内气压保持为常压。用数字测氧仪（Ceramatec公司生产的Maxo2Oxygen Anal Yzer,Model OM25AE）测量舱内的氧浓度，氧浓度稳定后每间隔2h监测1次，使其始终保持在800±20mL/L。每天打开氧舱更换垫料、加水、添食1次。在此环境中饲养5d，然后回到正常氧环境下继续饲养5d至第17d。正常对照组新生鼠与母鼠饲养于正常氧环境至第17d。
1.2方法
按Browning等[7]报道的墨汁灌注显色法，在第18d时进行视网膜铺片，即在钟形罩下乙醚吸入深度麻醉，心脏灌注墨汁与明胶水溶液（1∶50）混合液，比例为1∶2，每只幼鼠灌注3mL，而后迅速取出双侧眼球，固定于40g/L多聚甲醛中24h，将其中1只眼球在解剖显微镜下去除角膜、晶状体、玻璃体、脉络膜和巩膜。完整剥离视网膜组织，以视乳头为中心做4个放射状切开，将视网膜平铺于挂胶载玻片上，500mL/L甘油封片后在光镜下观察视网膜新生血管发生情况。取另1眼放入40g/L多聚甲醛溶液中4℃固定24h后，去除前节，制作成眼杯。酒精常规梯度脱水、石蜡包埋，切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位连续4μm切片，HE染色，光学显微镜下对视网膜血管内皮细胞核进行计数。每只眼球取20张切片，相邻两张间隔30μm，用双盲法计数血管内皮细胞核，统计每只眼球每张切片突破内界膜的内皮细胞核数。选取切片时应避开视乳头周围，仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核[8]。
统计学处理：实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析。所有数据均以统计分析软件包SPSS11.0进行分析。
2结果
2.1视网膜血管形态和密度分布
视网膜铺片观察发现，正常对照组第18d新生鼠视网膜血管,自视盘发出向四周呈放射状均匀分布, 直至视网膜周边部。管径较粗, 分支良好, 周边部视网膜血管网结构清晰，形态正常(图1A，C，E)。与正常SD大鼠和CSNB大鼠比较，RCD大鼠视网膜血管的网络结构虽然存在，但是其视网膜血管网络结构中的微血管数目明显减少。在高氧/复氧作用下，各实验组大鼠视网膜血管正常网络状结构受到破坏，结构稀疏，血管迂曲、收缩或扩张，部分血管出现闭塞(图1B，D，F)，其中SD大鼠、CSNB大鼠视网膜发现有出血点甚至片状出血（图1B，D）。
2.2大鼠视网膜组织病变
饲养在正常氧环境下的新生大鼠视网膜各层组织结构未见明显异常改变，未见有明显的新生血管形成，仅在正常SD大鼠中偶可观察到突破内界膜的内皮细胞（0.28±0.20）（图2A，C，E）。经过高氧/复氧处理的各实验组大鼠各层基本结构存在，但是视网膜表面失去了正常光滑的界面。许多新生毛细血管突破视网膜内界膜长入玻璃体内，在视网膜前和视网膜浅层形成大量新生血管芽，血管内皮细胞核突破内界膜，甚至伴有玻璃体出血（图2B，D，F）。实验组中SD大鼠、CSNB大鼠和RCD大鼠3种品系中均可见较多的突破内界膜内皮细胞核，计数结果为SD大鼠每张切片突破内界膜的内皮细胞核个数为24.10±2.49个，CSNB大鼠每张切片突破内界膜的内皮细胞核个数38.20±10.47个，RCD大鼠每张切片突破内界膜的内皮细胞核个数高达68.00±3.06，与同品系的对照组有显著性的差异（P<0.01）；与不同品系的实验组比较也均有显著性差异（P<0.01）。其中突破内界膜的内核细胞数以RCD（68.00±3.06）大鼠最多，较正常SD大鼠多约近3倍，较CSNB大鼠多约1倍。
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