【摘要】 目的：研究不同浓度的过氧化氢(H2O2)对体外培养的人晶状体上皮细胞增生及VEGF表达的影响。方法：体外培养的人晶状体上皮细胞系SRA01/04，在培养液中分别加入浓度为1，10，100nmol/L；1，10，100μmol/L和1mmol/L的过氧化氢处理40min，对照组无过氧化氢，随后在正常培养液中继续培养，在0，6，12和24 h用MTT方法检测晶状体上皮细胞的增生活力；在24h用ELISA方法检测培养液上清中血管内皮生长因子（VEGF）的含量。结果：在培养液中加入1nmol/L～10μmol/L浓度的H2O2处理组，晶状体上皮细胞增生率（A值）随浓度较对照组明显增加，其中以10nmol/L最为明显；而100μmol/L,1mmol/L处理组，晶状体上皮细胞出现生长抑制。ELISA检测结果显示，1nmol/L～10μmol/L的过氧化氢刺激后，VEGF水平均高于对照组，且呈浓度依赖性，峰值出现在10nmol/L和10μmol/L H2O2处理组。结论：低浓度（1nmol/L～10μmol/L）的H2O2可以促进晶状体上皮细胞增殖，并使VEGF分泌增加；提示VEGF可能作为一种氧化应激产物，对晶状体上皮细胞起到保护、免受损伤的作用。
【关键词】 晶状体上皮细胞；过氧化氢；氧化应激；VEGF
Effects of hydrogen peroxide on the proliferation and VEGF expression of human lens epithelial cells
XiaoRong Guan, Jian Zhou, YanNian Hui, ZiFeng Zhang, Qian Du, Le Zhang
Foundation items: National Natural Science Foundation of China (No.30672292); Program for New Century Excellent Talents of Ministry of Education
Department of Ophthalmology, Eye Institute of Chinese PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China
Correspondence to: Jian Zhou. Department of Ophthalmology, Eye Institute of Chinese PLA, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xian 710032, Shaanxi Province, China.
AbstractAIM: To investigate the effects of hydrogen peroxide (H2O2) at various concentrations on the proliferation and VEGF expression of human lens epithelial cells in vitro.
METHODS: Human epithelial cells SRA01/04 were used. The cells were treated with H2O2 at various concentrations of 1nmol/L, 10nmol/L, 100nmol/L, 1μmol/L, 10μmol/L, 100μmol/L and 1mmol/L respectively. The controls were cultured in the medium without H2O2. After treated for 40 minutes, the cells were then cultured in normal condition for additional 24 hours. The survival and proliferation of the cells was quantified by MTT assay before treatment and at 6, 12, 24 hours after the treatment of H2O2. The concentration of VEGF in the supernatants was measured by ELISA at 24 hours after the treatment of H2O2. RESULTS: The proliferation rates (A values) of the human lens epithelial cells treated with 1nmol/L to 10μmol/L of hydrogen peroxide increased significantly compared to that of the controls, in a dosedependent manner. Of them, the highest A value was in the cells treated with 10nmol/L H2O2. However, high dose (100μmol/L and 1mmol/L) of hydrogen peroxide suppressed the proliferation of the cells. ELISA test showed that the VEGF levels were elevated also in a dose dependent manner at low dose (1nmol/L 10μmol/L) of hydrogen peroxide. The peak level of VEGF appeared in the cells treated with 10nmol/L and 10μmol/L of H2O2.CONCLUSION: Hydrogen peroxide at low dose may stimulate the proliferation of lens epithelial cells, and increase production of VEGF, indicating that VEGF can be a product of oxidative stress and serve protection for lens epithelial cells from damage.
KEYWORDS: lens epithelial cell; hydrogen peroxide; oxidative stress; VEGF
0引言
白内障是世界主要致盲性疾病之一。研究认为紫外线和可见光能诱发晶状体产生氧自由基是导致老年性白内障的主要因素[1]。多数白内障患者前房内的过氧化氢（H2O2）含量明显升高[2]。H2O2可刺激晶状体上皮细胞分泌一些生长因子如CTGF[3]、LEDGF[4]，从而产生相应的生物学效应。血管内皮生长因子（VEGF)在肿瘤及新生血管相关疾病中得到了广泛的关注。但在一个无血管分布的器官—晶状体中，VEGF对晶状体细胞的作用以及对晶状体疾病有什么作用，我们知之甚少。已有研究发现H2O2能够诱导多种细胞上如骨髓细胞[5]、角质形成细胞[6]、巨噬细胞[7]、血管内皮细胞[8]、心脏内皮细胞[9]和视网膜色素上皮细胞[10]等分泌VEGF。那么，在晶状体老化的过程中，晶状体上皮细胞有没有可能在眼内如前房内较高的氧化物作用下产生VEGF？VEGF又可能引起什么生物效应呢？本研究旨在探讨不同浓度的H2O2对晶状体上皮细胞分泌VEGF以及细胞增生能力的影响。
1材料和方法
1.1材料
人晶状体上皮细胞系SAR01/04由本实验室张自峰惠赠，DMEM培养液（Dulbeccos modified Eagle medium，HYQ公司）,胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，天津灏阳生物制品有限公司),胰蛋白酶(Gibco公司),二甲基亚砜（Sigma公司)，人VEGF ELISA试剂盒 (Minneapolis, MN公司)，四甲基偶氮唑(methyl thiazole tetrazolium，MTT，天津灏阳生物制品有限公司)。CO2培养箱（SHELLAＢ型，美国），医用净化工作台（YJ875，苏州），酶联免疫检测仪（Olympus公司），BX50光学显微镜（Olympus公司），IX70倒置显微镜及照相系统（Olympus公司）。
1.2方法
1.2.1晶状体上皮细胞培养
SAR01/04细胞用含150mL/L FBS的DMEM培养基在25cm2的细胞培养瓶内培养，置37℃，50mL/L CO2及充分饱和湿度的培养箱内，隔天换液，待细胞长至融合后，用2.5g/L胰蛋白酶液消化，离心，制成单细胞悬液，按照1∶3比例进行传代。
1.2.2晶状体上皮细胞的处理与分组
将长至融合的细胞用2.5g/L胰蛋白酶液消化，离心，制成单细胞悬液，按照每孔5×103个细胞接种于96孔板，每孔中加入含150mL/L FBS的DMEM培养基100μL，常规培养，孵育16h，待细胞充分贴壁，按实验分组进行处理。共设4个检测时间点，分7个H2O2处理组（H2O2浓度分别为1,10,100nmol/L ；1,10,100μmol/L及1mmol/L）和一个无H2O2对照组。按照规定浓度，将新鲜配制的H2O2加入含10mL/L FBS的DMEM培养液中处理细胞，在孵育40min后更换培养液，用含150mL/L FBS的DMEM培养液继续培养，分别于H2O2处理后0，6，12，24h取出培养板，进行MTT细胞增殖活力检测。于24h进行ELISA VEGF含量检测。
1.2.3 MTT比色法测定晶状体上皮细胞增殖活力
为测定晶状体上皮细胞增殖活力，分别对上述培养的细胞在处理后0，6，12和24h取出对应的培养板，分别在待测孔中加入10μL，5g/L MTT试剂，继续孵育4h，弃去上清液，在各孔中加入100μL DMSO，使各孔内沉淀充分溶解。用酶联免疫检测仪在490nmol/L处读取各孔A值。每组设3个复孔，反复试验3次。与实验组平行设立只有培养液不加细胞的空白对照孔，在比色时以此孔调零。记录各组调零后的A值,并计算平均值。共进行了3次完全独立实验。按照相对增殖率=实验组平均A值/对照组平均A值计算出各处理组细胞的相对增殖率。
1.2.4 ELISA检测培养液上清VEGF水平
细胞在H2O2处理24h后，提取待测孔内细胞培养上清液，12000r/min离心5min，取上清液，按检测VEGF的ELISA试剂盒提供的操作步骤，检测各孔VEGF含量。建立VEGF标准曲线，设立对照孔及空白孔。记录各组调零后的A值,计算平均数。共进行了3次完全独立的实验。按照VEGF相对A=实验组平均A值/对照组平均A值,计算出各处理组细胞分泌VEGF的相对量。
统计学处理：用3次实验数据计算平均值，以±s表示，采用统计软件SPSS 12.0进行ANOVA方差分析及配对t检验。P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1 H2O2处理后晶状体上皮细胞形态变化
光学显微镜观察,未经处理的细胞为多角形,在未汇合处呈长条形或梭形,已汇合细胞更加规则,呈近似六边形;细胞胞质透明,胞核及核仁可见。低浓度H2O2处理组细胞形态与未处理组无明显差异。100μmol/L及1mmol/L H2O2组则有明显不同，在H2O2处理后，细胞形态迅速发生变化，出现皱缩、轮廓增强、边缘僵硬，随着培养时间的推移，细胞形态无明显恢复，尤其是1mmol/L H2O2处理组。
2.2不同浓度的H2O2对晶状体上皮细胞增殖活力的影响
用MTT比色法检测不同浓度的H2O2对细胞增殖活力的结果显示，在低浓度范围（1nmol/L～10μmol/L）H2O2刺激细胞增生，在6，12和24h各时间点上细胞的增殖力均高于无H2O2对照组，而且有明显的剂量依赖趋势，在10nmol/L H2O2组出现细胞增殖高峰（图1），而在高浓度（1mmol/L和100μmol/L）H2O2处理组，晶状体上皮细胞增生活力均低于对照组（图1），结合对细胞形态的观察结果，我们发现高浓度H2O2抑制细胞增生甚至引起细胞死亡。进一步分析可以看出，在不同时间点上H2O2对细胞的增殖活力影响的程度不尽相同。在6h时，不同浓度H2O2对晶状体上皮细胞增殖活力影响的差别最大，随着培养时间的延长，各组之间的差异逐渐减小(图2)。1nmol/L～10μmol/L H2O2引起细胞增殖力的变化在6h时是对照组的1.51±0.29～2.88±0.13倍，在12h时是对照组的1.54±0.41～2.29±0.61倍，在24h时是对照组的1.42±0.76～2.01±0.86倍。在高浓度（1mmol/L和100μmol/L）时，各时间点细胞的增殖活力均低于正常对照组，仅是对照组的0.46±0.27～0.78±0.14倍。
2.3不同浓度的H2O2对晶状体上皮细胞分泌VEGF的影响
VEGF ELISA检测结果显示，低浓度（1nmol/L～10μmol/L）H2O2刺激可刺激人晶状体上皮细胞分泌VEGF，与对照组相比VEGF分别是它的1.24±0.15～1.51±0.22倍，峰值在10nmol/L（1.49±0.18倍）和10μmol/L（1.51±0.22倍）处，均与对照组有显著差异（P<0.05）。而在100μmol/L及1mmol/L处理组VEGF表达量与对照组无显著差异，而且明显低于10nmol/L组（P<0.05，）。H2O2刺激VEGF分泌的剂量范围与它刺激晶状体细胞增殖的剂量范围一致。
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