【摘要】目的: 探讨β1整合素过表达对角膜上皮细胞黏附和迁移的影响机制。方法: 将β1整合素GFP融合蛋白真核细胞重组表达质粒转染兔角膜上皮细胞，观察转染细胞的融合基因表达以及细胞的黏附和迁移能力。检测β1整合素转染对角膜上皮细胞粘着斑激酶（FAK）磷酸化的影响。结果: 成功将β1整合素GFP融合蛋白转染至兔角膜上皮细胞并使其过表达；β1整合素过表达能够明显增加角膜上皮细胞的黏附和迁移能力（P＜0.05)并促进FAK磷酸化（P＜0.05)。结论: β1整合素过表达能够明显促进角膜上皮细胞的黏附和迁移。
【关键词】 角膜上皮细胞；β1整合素；黏附；迁移
β1integrin overexpression induces the ability of adhesion and migration of rabbit corneal epithelial cells
YouDong Wang, JinSong Zhang
Foundation item: Science and Technology Research Program of Educational Department of Liaoning Province, China (No.20061000)
Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110005, Liaoning Province, China
Correspondence to: YouDong Wang. Department of Ophthalmology, the Fourth Affiliated Hospital of China Medical University, Shenyang 110005, Liaoning Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To investigate the effect of β1integrin overexpression on the ability of adhesion and migration of rabbit corneal epithelial (RCE) cells.METHODS: Eukaryotic expression vector encoding β1integrinGFP fusion DNA was transfected into RCE cells, the β1integrinGFP fusion gene was examined by RTPCR and Western blotting. The adhesion to Matrigel and the migration of transfected cells were determined by adhesion assay and mobility assay. The phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) was examined by Western blotting. RESULTS: RCE cells overexpressing β1integrinGFP fusion gene were successfully established. β1integrin transfection significantly promoted the adhesive ability of RCE cells to Matrigel（P<0.05）. β1integrin overexpression promoted the migration ability and induced FAK phosphorylation in RCE cells（P<0.05）.CONCLUSION: These data suggest that overexpression of β1integrin promote the ability of adhesion and migration of RCE cells, and FAK pathway may play an important role in this process.
KEYWORDS: corneal epithelial cells; β1integrin; adhesion; migration
0引言
外伤性角膜上皮缺损愈合缓慢或反复发生,尽管现有的治疗手段已取得了一定的效果,但疗效上仍不够满意。细胞的黏附和迁移是伤口愈合的起始环节，如何提高角膜上皮细胞的黏附和迁移能力是决定角膜上皮能否快速完整修复和愈合的关键，也是近年来研究的热点。β1整合素家族是介导细胞与细胞外基质黏附并将细胞外基质信号向胞内传递的最主要的细胞表面受体，在细胞的分化、黏附、迁移及创伤修复过程中起重要作用[1]。我们运用分子生物学手段将β1整合素绿色荧光蛋白(GFP)真核细胞重组表达质粒转染角膜上皮细胞并使β1整合素过表达，探讨了β1整合素过表达对角膜上皮细胞黏附和迁移能力的影响及其机制，为了解β1整合素在角膜损伤修复中的作用以及临床治疗角膜损伤提供理论依据。
1 材料和方法
1.1材料
细胞培养液采用HamsF12 和DMEM 的混和液(1∶1), 其中加有100mL/L胎牛血清、100kU/L 的青霉素、100mg/L 的链霉素、谷氨酰胺20mg/L, 用碳酸氢钠调培养液pH 7.2～7.4。培养液和胎牛血清购自美国Gibco公司，24,12及6孔培养板为Falcon产品，抗粘着斑激酶（FAK）磷酸化特异性抗体和抗FAK总表达抗体购自美国Cell Signaling公司。取体质量2.5～3.0kg 的成年荷兰家兔，空气栓塞处死后，立即无菌取出眼球,用生理盐水冲洗数次。在超净工作台中分离出仅含上皮层及基质层的角膜，浸入2.5g/L胰蛋白酶3mL中4℃消化过夜。次日用刮刀轻柔刮取角膜上皮，用Hanks溶液冲洗3次后, 加入含10mL/L 胎牛血清的培养液2mL轻轻吹打, 使细胞均匀分散后, 接种于24孔或6孔培养板，置于37℃，50mL/L CO2孵箱内培养。实验时，用培养液调整细胞浓度为4×108/L, 待用。
1．2 方法
β1整合素GFP融合质粒pEGFPN1/GFβ1质粒由Dr. Ozaki (Saga University, Japan) 提供，其中含全长编码序列的β1整合素cDNA[2]。将2～4 代细胞接种于培养板中至细胞达80%的融合，采用Lipofectamine (GIBCO)基因转染技术 (参见厂家说明)，分别将pEGFPN1/GFβ1表达载体及pEGFPN1空载体转染细胞。在37℃，50mL/L CO2培养箱中培养12h, 弃去转染液,加入正常血清的培养液, 继续培养2d后用于下一步实验。β1整合素表达质粒转染细胞和空载体转染细胞分别命名为β1和Mock。
1.2.1 RTPCR检测
细胞总RNA的提取采用ISOGEN总RNA提取试剂盒(Nippon Gene, Japan)，具体方法参见厂家说明。电泳鉴定RNA质量并在A260nm测其浓度。所有引物均经GenBank查询为目前已知基因特异性引物序列。GFP (U55762)：sense 5’GCAAGCTGACCCTGAAGTTCATC3，antisense 5GGATCTTGAAATTCACCTTGATGC3，384 bp。β1整合素(NM002211)：sense 5AGAATCCAGAGTGTCCCACTGG3，antisense 5TTCCCTCATACTTCGGATTGA3，238 bp。Glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase (GAPDH) (NM002046)：sense 5ACGCATTTGGTCGTATTGGG3，antisense 5TGATTTTGGAGGGATCTCG C3，231 bp。以正义β1整合素和反义GFP为引物来检测β1整合素GFP融合基因的表达情况，产物长度为785bp。 按第1链合成试剂盒说明进行逆转录 (Takara, Japan)。PCR扩增条件：变性95℃ 1min，退火55℃ 1min，延伸72℃ 1min，循环30次。PCR产物以20g/L琼脂糖凝胶电泳检测，用溴化乙锭染色后长波紫外灯下观测照相。
1.2.2 细胞黏附实验
Matrigel(30μg/孔)包被24孔培养板后37℃过夜待用。对照组以10g/L BSA包被培养板。37℃ 1g/L BSA封闭各孔板1h后，将β1整合素GFP融合基因表达质粒或空载体表达质粒转染细胞按5×104个细胞(500μL)/孔将细胞加入包被的24孔板，50mL/L CO2培养箱内于37℃孵育1h。PBS漂洗3次移去悬浮细胞，黏附细胞数经WST1细胞增殖试剂盒测定A进行评估。
1.2.3 趋化迁移实验
取Transwell培养板，用Boyden小室进行跨膜迁移实验，上室聚碳酸酯膜微孔滤膜孔径为8μm。将β1整合素GFP融合基因表达质粒或空载体表达质粒转染细胞按3×105个细胞(500μL)/孔接种至小室上层，下层添加纤维连接蛋白，培养24h后取出滤膜，用棉签轻轻擦去上面的细胞后，用甲醛固定20min。自来水漂洗，Giemsa染色10min，在光学显微镜下随机取4个视野计数通过8μm孔径微孔迁移到膜下层的细胞。
1.2.4转染细胞FAK磷酸化的检测
转染后8h收集角膜上皮细胞，PBS洗后离心弃上清，适当体积裂解缓冲液 [50mmol/L TrisHCl (pH7.5)，150mmol/L NaCl，5mmol/L 乙二胺四乙酸 (EDTA, pH8.0)，1mmol/L 苯甲基磺酰氟 (PMSF)， 1g/L SDS，1mg/L 抑肽酶，10mg/L抑胃酶肽，10mg/L亮抑蛋白酶肽，10mg/L抑蛋白酶肽，10mg/L大豆胰蛋白酶抑制剂] 重悬细胞，超声裂解细胞45s，4℃ 15000r/min离心20min，收集上清70℃保存。BCA定量试剂盒测定蛋白浓度(BioRad)。取等量蛋白泳道上样，经10g/L SDSPAGE电泳，电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。封闭缓冲液 (0.1mmol/L TBS,50g/L脱脂奶粉，1g/L吐温20)封闭，加入1∶1000抗FAK特异性磷酸化抗体及抗FAK总表达抗体4℃孵育过夜。1∶2000稀释的酶标二抗室温孵育1h，TBS洗净后，增强化学发光剂(ECL)显色，暗房中压片，观察结果。
统计学处理：差异显著性采用t检验，P<0.05为差异有显著意义。
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