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2结果
2.1 β1整合素
GFP融合基因在角膜上皮细胞中的表达GFP mRNA在空载体及β1整合素GFP融合基因转染的角膜上皮细胞中均有表达，但仅转染β1整合素GFP融合基因的细胞在785 bp部位出现条带（图1A），表明β1整合素GFP融合基因已成功地转染至角膜上皮细胞并在mRNA水平进行了表达。此外，与空载体细胞相比，β1整合素GFP融合基因转染细胞的β1整合素mRNA表达水平明显上调。Western 印记显示140kDa大小条带（代表β1整合素GFP融合蛋白大小）和113kDa大小条带（代表β1整合素蛋白大小）出现在β1整合素GFP转染的角膜上皮细胞中，而空载体转染细胞仅在113kDa处出现β1整合素条带（图1B），表明β1整合素GFP融合蛋白已在角膜上皮细胞中进行了表达。
2.2 β1整合素
GFP融合蛋白转染对角膜上皮细胞体外黏附的影响 β1整合素GFP融合蛋白转染（图2)与空载体转染细胞相比，β1整合素GFP融合蛋白转染细胞对Matrigel (Collaborative Biomedical Products,USA)的黏附力明显增高(P<0.05)，而各细胞在10g/L BSA上的黏附情况则无显著差别。
2.3 β1整合素
GFP融合蛋白转染对角膜上皮细胞体外迁移的影响 β1整合素GFP融合蛋白转染（图3）与空载体转染细胞相比，β1整合素GFP融合蛋白转染细胞的跨膜迁移能力明显增高(P<0.05)。
2.4 β1整合素
GFP融合蛋白转染对角膜上皮细胞FAK的影响 β1整合素GFP融合蛋白转染能够促进FAK磷酸化（图4），提示FAK在β1整合素促进细胞黏附和迁移过程中可能起着重要的作用。 图3转染细胞的跨膜迁移 A:Mock; B:β11; C:β12
3 讨论
角膜上皮是防御外界致病因子侵犯的物理屏障,能否迅速完整地修复角膜上皮缺损, 是恢复角膜的屏障功能、促进创伤愈合、保持良好视力的关键。由于角膜损伤修复的早期细胞尚未进行有丝分裂，组织的修复主要靠角膜上皮细胞与细胞外基质的黏附及细胞移行来控制创面。因此, 提高角膜上皮细胞的黏附和迁移能力对临床上治疗角膜上皮细胞屏障功能障碍及促进创伤愈合极为重要。我们的结果表明，β1整合素过表达能够明显促进角膜上皮细胞对细胞外基质的黏附及细胞迁移作用，而FAK磷酸化很可能在此过程中发挥重要的作用。β1整合素家族是介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间的黏附并负责将细胞外基质信号向胞内传递的最主要的细胞表面受体，它们通过与细胞外基质中的特殊氨基酸序列结合, 形成细胞外基质整合素细胞内骨架系统, 引起细胞形态改变, 从而介导细胞的黏附与迁移[2]。由于细胞的粘附和移行是细胞增殖的前提，是伤口愈合的起始环节，因此，近年来整合素在角膜创伤愈合中的作用已逐渐受到关注。有研究证明β5β1整合素在角膜创伤后的表达明显增高[3]，提示它很可能参与了角膜上皮创伤愈合过程中上皮细胞之间的粘附和细胞在基底膜上的移行以及角膜创伤修复过程中的再上皮化过程, 揭示了在创伤愈合的早期整合素就已参与损伤修复的可能性。我们的转基因结果直接证明了这种可能，即β1整合素过表达能够明显促进角膜上皮细胞与细胞外基质和基底膜的黏附及细胞的迁移, 而这种黏附和迁移能力的增加势必在角膜上皮创伤愈合过程中发挥重要的作用。整合素促进细胞黏附和迁移的机制，与钙激活蛋白酶、FAK和Rho通路活化有关[47]。我们的结果首次证明了β1整合素过表达能够导致角膜上皮细胞中FAK磷酸化，而β1整合素介导的FAK磷酸化很可能是β1整合素过表达促进角膜上皮细胞黏附和迁移的重要机制。确实，整合素在细胞表面的集簇表达能够使FAK在黏着斑部位的快速集中并同时发生自身酪氨酸磷酸化，从而激活下游的细胞迁移信号分子如细胞骨架蛋白等，引发细胞的变形、收缩和迁移[8,9]。目前认为，FAK是细胞迁移信号传导和整合的关键分子，我们将进一步研究FAK下游分子在角膜上皮细胞黏附和移行中的作用，以便在加深角膜上皮损伤修复机制认识的同时，从激活细胞迁移信号转导途径上寻找促进细胞迁移的新措施，为加速角膜损伤修复提供新的思路。
【参考文献】
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6 Le Boeuf F, Houle F, Sussman M, et al. Phosphorylation of focal adhesion kinase (FAK) on Ser732 is induced by rhodependent kinase and is essential for prolinerich tyrosine kinase2mediated phosphorylation of FAK on Tyr407 in response to vascular endothelial growth factor. Mol Biol
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7 王欣玲,于韬,张国刚,等. bFGF对人晶状体上皮细胞中FAK表达的影响. 国际眼科杂志 2007;7(2):336338
8 Hashimoto K, Sonoda Y, Yamakado M, et al. C/EBPalpha inactivation in FAKoverexpressed HL60 cells impairs cell differentiation. Cell Signal 2006;8(7):955963
9 Kimura K, Hattori A, Usui Y, et al. Stimulation of corneal epithelial migration by a synthetic peptide (PHSRN) corresponding to the second cellbinding site of fibronectin. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48(3):11101118 上一页 [1] [2] |
