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2结果
2.1组织块贴片法
晶状体囊膜片接种后贴附于培养瓶底,原代培养4～5d，可见少许细胞自囊片边缘外生移出,散在细胞簇也已贴壁,细胞呈扁平的不规则多边形,胞质透明,核为圆形、色暗。大小、形态较为均一,向四周呈单层贴壁生长。随时间延长细胞密度增大，2wk左右逐渐融合,囊膜片边缘处细胞生长密集,细胞大小较均一,形态较规则,周边处细胞生长稀疏,胞体延伸呈长梭形,细胞大小不等,形态欠规则（图1）。在大片融合细胞中，可以见到两种形态的细胞,一种呈多边形融合的细胞团，表现为上皮细胞的特点(（图2中短箭头所示）。另一种呈长梭形融合,表现为成纤维细胞的特点.（图2中长箭头所示）。这些细胞源于上皮细胞团的外围，夹杂于上皮细胞团之间。
2.2酶逐步消化法
倒置显微镜观察，原代细胞经胰酶消化后,成圆形,细胞间距增大,多数成孤立的单个细胞，少数为散在细胞簇。培养7d后,部分晶状体上皮细胞即可贴壁呈拉长的楔形（图3），逐渐转变为多边形,呈单层排列，培养至2wk时，细胞呈单层融合，融合区的细胞呈多边形，大小，形态较均一，胞质透明（图4）。
3讨论
晶状体上皮细胞是紧密贴附于晶状体前囊膜内表面的一单层上皮细胞,担负着晶状体的生长、分化和修复损伤的功能。白内障摘除术后前后囊膜混浊的形成是一个相当复杂的机体损伤的修复反应,是残留的晶状体上皮细胞在前后囊膜上的增殖、移行及在增殖过程中部分细胞发生纤维化生,最终引起前后囊膜的皱缩和纤维化[3,4]。
自从1969年Bermbach等[5]首次报道晶状体上皮细胞体外培养技术以来，牛、鼠、兔、鸡以及人的晶状体上皮细胞体外培养相继获得成功，国内在这方面的工作起步较晚，目前尚无鼠晶状体上皮细胞细胞体外培养成功的报道。本试验采用组织块贴片法和酶逐步消化法对鼠晶状体上皮细胞进行体外培养,并取得了成功。在培养鼠晶状体上皮细胞的过程中，一定要注意以下几个环节：(1)严格无菌操作，取出眼球用250U/mL庆大生理盐水浸泡10min，共3次，避免原始污染；(2)鼠的晶状体上皮细胞对胰酶极其敏感，我们尝试了不同的酶消化时间，发现酶消化时间如果超过3min，细胞的活性便会显著降低，细胞不能贴壁。所以在酶消化过程中，最好保持在镜下观察，发现细胞游离后，伴以轻微摇荡，便收集上清。如此重复，最多3次，因为余下的细胞基本没有活性；(3)鼠的晶状体上皮细胞对机械吹打同样非常敏感，稍微过度的吹打和离心都会影响细胞的活性，因而吹打要少而轻柔，离心的速率和时间保持在800r/min和8min即可；(4)鼠晶状体上皮细胞的贴壁过程极为缓慢，这与晶状体上皮细胞本身的特性有关，也与鼠的晶状体上皮细胞小、轻、难以下沉有关。因此培养液的量要适当，过多容易导致细胞的漂浮时间过长，影响细胞活性，导致细胞最终不能贴壁；(5)在组织块培养法中要注意鼠的晶状体囊膜不容易牢固贴壁，为了增加囊膜贴壁的牢固性，最好将培养瓶站立或倒置2h后再端放；(6)在组织块培养法中要注意组织块放置的密度。在图2中可以看到即使在原代培养的晶状体囊膜中，也出现有纤维化改变的细胞。这些细胞在上皮细胞团的外围，提示由上皮细胞增殖转化而来。体外培养的晶状体上皮细胞通常在第3代后发生上皮向间质的转化[6]，但如果组织块放置太稀疏或不均匀，细胞的增殖就会出现不均匀的现象，部分区域过早出现转化。这样的细胞并不适合用于进一步的细胞内分子机制研究。因此组织块的大小和放置要均匀，并要有适当的密度。
鼠晶状体上皮细胞体外培养模型的建立为研究后发性白内障提供了有效的研究手段,可以使后发性白内障的病因和发病机制的研究深入到细胞分子水平。在体外培养条件下,可以在几代以内完成晶状体上皮细胞转化过程的所有特征,定量和清楚地显示其在后发性白内障中的作用和机理[7]。为进一步开展体外药物抑制实验打下了基础。对寻找有效药物防治该并发症具有重要意义。
【参考文献】
1 Goldhammer EI, Zaid G, Tal V, et al. QT dispersion in infants with apparent lifethreatening events syndrome. Pediatr Cardiol2002;23(6):605607
2 Dewey S. Posterior capsule opacification. Curr Opin Ophthalmol2006;17(1):4553
3 Spalton DJ. Posterior capsular opacification after cataract surgery. Eye1999;13(Pt 3b):489492 上一页 [1] [2] |
