【摘要】 目的 观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生物学特性。方法 组织块贴壁法培养人胚晶状体上皮细胞，通过倒置相差显微镜、透射电子显微镜，采用免疫细胞化学法分析人胚晶状体上皮细胞的生长特性。结果 体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48～72ｈ后从组织块边缘长出，具有上皮细胞的形态特点，第10天达到融合。第二代人胚晶状体上皮生长曲线近“S”形，经过1～2ｄ的潜伏期后进入对数生长期，需10d左右达到融合，细胞形态呈六角形或椭圆形、超微结构保持正常，免疫细胞化学SABC法染色结果显示细胞浆内α－晶状体蛋白染色阳性。结论 人胚晶状体上皮细胞具有增殖能力，第二代人胚晶状体上皮细胞是进行白内障相关研究的合适实验对象。
【关键词】 晶状体 上皮细胞 细胞培养 人胚
2. Department of Ophthalmology, Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University, Shanghai 200031, China)
To investigate the biological characteristics of human embryonic lens epithelial cells cultured in vitro. Methods Human embryonic lens epithelial cells were cultured by the explanting culture methods. An inverted phase contrast microscope, electron microscope and immunocytochemistry were used to study the growth specialties of the human embryonic lens epithelial cells. Results Human embryonic lens epithelial cells of primary culture in vitro grew out of the edge of tissue pieces after incubation for 4872 hours. The primary cultured cells maintained typical morphology of the epithelial cells and reached a confluence in 10 days. Growth curves of cultured human embryonic lens epithelial cells in passage 2 showed an Sshape. After a 12 day latent period, the cultured cells logarithmically grew and reached a confluence in 10 days. The shape of human embryonic lens epithelial cells in passage 2 was hexagon or oval with normal ultrastructure. Positive staining of αcrystalline was shown in passage 2 cultured human embryonic lens epithelial cells by immunocytochemistry. Conclusion Human embryonic lens epithelial cells have proliferative capacity and are suitable for related study of cataracts.
Key words： Lens; Epithelial cell; Cell culture; Human, embryo
晶状体上皮细胞是紧密贴附于晶状体前囊内表面的单层上皮细胞，其异常增殖、分化与白内障及白内障术后后囊膜混浊的发生密切相关。体外培养晶状体上皮细胞（lens epithelial cells， LEC）是观察晶状 体上皮细胞形态变化并研究其生物学特性的基础。然而，人晶状体上皮细胞的体外生长活性较差，对生长介质要求高，体外培养难度较大。我们通过观察体外培养人胚晶状体上皮细胞的生长特性，为从细胞分子水平研究白内障的发生提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料 选用胎龄为3～4个月因外伤而流产的胎儿（由复旦大学附属妇产科医院及国际和平妇婴保健院提供）。主要试剂为DMEM培养基粉剂（美国Gibco公司）、L谷氨酰胺（美国Gibco公司）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，美国Gibco公司）、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid， EDTA，上海化学试剂公司，分析纯）、胰蛋白酶（美国Sigma公司）、兔抗人α晶状体蛋白抗体（德国Serotec公司）、生物素标记的羊抗兔IgG（普飞生物试剂公司）、链亲和素标记的过氧化物酶，DAB显色液（美国Lab Vision公司）。仪器主要有超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜、血球计数板。
1.2 实验方法
1.2.1 人胚晶状体上皮细胞培养 取胎龄为3～4个月因外伤而流产的人胚眼球，将其浸泡于混有4万U庆大霉素和0.6g林可霉素的10mL生理盐水中10min。取出眼球后，沿角巩缘剪开眼球，完整取出晶状体，置于平皿中并用Hanks液冲洗净。在一阔口小培养皿中加入0.5mL FBS，将取下的晶状体立刻放入其中。用显微囊膜剪将其剪成直径约1mm×1mm大小的组织块。将FBS连同组织块一同吸出，移入50mL培养瓶中，5%CO2培养箱内37℃恒温培养。24h后，加入0.5mL含L谷氨酰胺的无血清DMEM培养液，48h后加入1mL含15% FBS 的DMEM培养液，每天在倒置相差显微镜下观察，当见到组织块边缘长出细胞时，加入3mL含20% FBS的DMEM培养液继续培养。以后每3～4d换一次含20% FBS 的DMEM培养液，当细胞生长接近融合时消化传代。
1.2.2 细胞生长曲线绘制 细胞生长接近融合时，用0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA按1∶1等比例混合消化液1mL消化约2min，相差显微镜下观察见细胞膜开始皱缩，细胞呈圆形，倒去消化液，加入含20%胎牛血清的培养液4mL终止消化，用吸管轻轻吹打使细胞从培养瓶上脱落下来。以每孔2×104细胞数将细胞接种在24孔板上，5%CO2培养箱内37℃恒温培养。每天取3孔计数，连续10d，绘制生长曲线。
1.2.3 细胞免疫学鉴定 以SABC法进行免疫细胞化学染色：将人胚晶状体上皮细胞以2×104/mL密度接种于盖玻片上，2d后取出用4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗5min×3次，15%小牛血清室温封闭20min；滴加1∶500兔抗人α晶状体蛋白抗体，4℃孵育20h后PBS漂洗5min×3次；再滴加1∶200生物素标记的羊抗兔IgG，在37℃湿盒内孵育1h；用PBS漂洗5min×3次后滴加链亲和素标记的过氧化物酶，37℃下反应15min后PBS漂洗5min×3次；加入DAB显色5～10min。以PBS代替一抗，作为空白对照。实验重复3次。
1.2.4 透射电镜检查 取生长已经达到融合的第二代人胚晶状体上皮细胞，用细胞刮刮下单层细胞，加入4℃预冷的PBS制成细胞悬液，5000r/min 离心5min，弃上清液，沿管壁缓缓加入4℃预冷的2.5%戊二醛溶液2mL预固定10min，1%锇酸后固定1h，梯度乙醇脱水，制成超薄切片于透射电镜下观察。
2 结 果
2．1 人胚晶状体上皮细胞的形态学特征 体外培养的原代人胚晶状体上皮细胞在组织块贴壁48h后从组织块边缘长出，起初细胞呈多角形、星形，有突起；以后细胞形态逐渐趋于典型的六角形，细胞透亮，胞浆丰富，胞体肥大，胞膜清晰；具有上皮细胞的形态特点。贴壁生长的晶状体上皮细胞逐渐增殖形成内密外疏的细胞群落，第10天达到融合（图1）。
2．2 人胚晶状体上皮细胞的生长曲线 原代人胚晶状体上皮细胞在传代后的生长曲线近“S”形，经过1～2d的潜伏期后进入对数生长期，10d左右达到生长稳定的平台期并融合（图2）。
2．3 免疫学鉴定 细胞免疫组化染色显示培养的第二代人胚晶状体上皮细胞胞浆内α晶状体蛋白染色阳性，呈棕黄色着染（图3A）。空白对照组染色阴性（图3B）。
A. 第二代人胚晶状体上皮细胞胞浆内α晶状体蛋白染色阳性（×200）
B. 空白对照组α晶状体蛋白染色阴性（×200）
2．4 透射电镜观察 培养的第二代人胚晶状体上皮细胞具有正常的超微结构，细胞核呈椭圆形，核染色质均匀，胞浆内细胞器丰富，富含线粒体、核糖体、粗面内质网及散在的溶酶体和高尔基体，微管和微丝（图4）。
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