【摘要】 目的：探讨低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜的表达及相关性。方法：将大鼠56只随机分为2组，每组各28只，分别饲养于常氧和50mL/L低氧仓。于饲养后0，2，6，8，12，24， 48h 各处死4只，分别进行光镜,电镜 ,免疫组化（SABC）测定HIF-1α及P53表达，并进行相关性分析。 结果: HIF-1α在缺氧后2h开始表达，8h达到高峰，12～24h持续强表达，48h表达明显下降。P53在缺氧后2h开始表达，以后表达逐渐升高，24h后表达达到高峰，48h表达明显下降。HIF-1α及P53在大鼠视网膜表达呈明显正相关（R =0.902495）。电镜结果显示在视网膜缺氧6h视网膜超微结构开始变化，24h凋亡达到高峰。结论：低氧条件下HIF-1α及P53在大鼠视网膜均有表达，随着HIF-1α的表达达到高峰后P53的表达达到高峰，两者呈明显正相关。P53表达达到高峰时电镜结果显示凋亡达到高峰。
【关键词】 低氧诱导因子-1α P53 视网膜低氧 大鼠
引言
低氧使细胞的生理功能发生改变，造成全身组织、器官失灌而损伤。 低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1, HIF-1)是1992年由Semenza等发现的。HIF-1可调控促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、糖酵解酶等多种基因的表达。视网膜细胞代谢的最大特点是耗氧多,对缺氧特别敏感，目前没有整体低氧情况下视网膜细胞HIF-1α表达的研究报道，也没有HIF-lα参与低氧视网膜细胞凋亡的证据。我们研究大鼠视网膜细胞缺氧后不同时间的HIF-lα，P53的表达，应用免疫组织化学技术，对低氧情况下视网膜细胞内HIF-1α及P53的蛋白表达进行了定量分析，探讨低氧环境下HIF-1α与P53的关系。并对视网膜超微结构进行电镜观察。
1材料和方法
1.1材料 常压低氧模型有机玻璃制成低氧仓，体积100cm×60cm×60cm有机玻璃厚4cm，三氯甲烷封侧面，以便开仓取换食物、水及取鼠。仓体上面开一直径1 cm的出气孔，侧面开一直径1cm的进气孔。通过三通管分别按氮气和压缩空气。用玻璃转子流量计（沈阳市北量流量仪器厂）控制流量。成年Wistar大鼠56只，雌雄不限。中国医科大学实验动物学部提供，质量170～220g随机分为2组，每组各28只，分别饲养于常氧环境，50mL/L低氧仓。于饲养后0，2，6，8，12，24，48h处死4只，分别进行光镜,电镜，免疫组化测定HIF-1α及P53表达。 兔抗鼠HIF-1α、P53抗体，免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.2方法
1.2.1免疫组织化学实验 大鼠处死后立即摘除眼球投入固定液（固定液配置：无水乙醇60mL，甲醇10mL 冰醋酸10mL，氯仿20mL）固定2h。室温脱水，整个眼球投入600，700，800，900，950mL/L乙醇各10min取出眼球用锋利刀片沿角膜两侧由后向前平行视轴剖切，包括角膜，晶状体，视神经，然后投入无水乙醇10min。硬脂酸：蜡1（3:7）2h；硬脂酸：蜡2（2:8）1h；石蜡3h（熔点52℃）。石蜡包埋，切片染色浸蜡后的眼球水平面朝向包埋框底，用石蜡蜂蜡混合包埋，冷却后切片机切片厚4μm。石蜡切片烤干，常规脱蜡至水，过氧化氢封闭阻断内源性过氧化物酶，Hci进行抗原修复，羊血清封闭电荷，阻断非特异性抗原抗体结合，弃去液体不洗。分别滴加一抗（HIF-1α抗体的工作浓度1：200，P53抗体的工作浓度1：200），4℃冰箱过夜。PBS(0.01mol/L pH7.2~7.4)洗后滴加FITC标记羊抗兔IgG(工作浓度1：1 000)，PBS冲洗，孵育，染色，DAB显色，苏木素复染，晾干，脱水，透明，封片PBS代替一抗做阴性对照。
1.2.2透射电镜操作 大鼠处死后取眼球，20mL/L戊二醛浸泡至少2h，经前固定，清洗，后固定，脱水，浸透，包埋，超薄切片后柠檬酸铅和醋酸钠进行双染色。观察并摄片。细胞核或胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为HIF-1α阳性表达细胞，细胞核或胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为P53阳性表达细胞，无阳性反应为阴性。在40倍物镜下摄取每组随机选取的视网膜切片，每张随机选取2个视野，转入计算机用Metamorph软件设定出阳性细胞阈值，并设定阳性框区。计算框区阳性细胞平均积分吸光度IOD值判定阳性细胞的表达情况。
统计学处理：分析软件用SPSS 10.0。
2结果
2.1 HIF-1α及P53的表达 常氧条件下各时间点HIF-1α及P53的表达极为微弱，缺氧24h P53的免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少有表达(图1A)。缺氧8h HIF-1α免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少量表达（图1B）。 缺氧2h即出现HIF-1α表达，随着时间延长表达逐渐增加。8h基本达到高峰，12～24h持续强表达，48h表达明显下降。缺氧2h即出现P53表达，随着时间延长表达逐渐增加。8h明显表达增强，24h基本达到高峰，以后下降（表1)。缺氧条件下HIF-1α及P53表达呈曲线变化（图2）。
图1 缺氧后HIF-1α及P53的表达。A：缺氧24h P53的免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少有表达；B：缺氧8hHIF-1α免疫组化的照片可见节细胞层强表达,内颗粒层有表达,外颗粒层少量表达
图2 HIF-1α和P53表达的相关性图示。由上图得知HIF-1α和P53表达呈正相关（r =0.902495 ）
2.2电镜结果 对照组光镜下未见明显异常，透射电镜下各层组织区分明显,细胞核仁明显,居中,核膜清晰,细胞器较多,结构清楚。神经节细胞无变性，线粒体嵴存在，粗滑面内质网无变性，粗面内质网无脱颗粒，神经纤维无水肿，而随着缺氧时间延长，6h出现超微结构变化，线粒体轻度膨胀，内质网有轻度扩张（图3A），24h出现神经节细胞变性，线粒体明显膨胀，嵴消失，滑面内质网扩张，粗面内质网脱颗粒扩张，内核层及内外丛状层中线粒体膨胀，核仁靠近核膜,细胞有损伤的变化。神经纤维层轴突水肿加重，结构疏松，但视锥，视杆细胞较完整，（图3B）。
图3电镜结果。A：缺氧6h后视网膜电镜改变:线粒体轻度膨胀，内质网有轻度扩张TEM×5 000；B：缺氧24h视网膜电镜改变:可见胞质空泡化，线粒体明显膨胀，嵴消失，滑面内质网扩张，核仁靠近核膜,细胞有损伤的变化TEM×6 000
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