【摘要】 目的：研究人类视网膜色素上皮细胞（human retinal pigment epithelium, HRPE）体外培养的转分化现象。
方法：倒置显微镜观察体外培养HRPE细胞形态变化；采用免疫细胞化学染色方法检测HRPE细胞角蛋白及α平滑肌肌动蛋白（αSMA）的变化。
结果：HRPE细胞体外培养时形态由上皮细胞特征变化成为间质样细胞；细胞角蛋白表达与传代代数呈负相关（r=0.831，P<0.001），αSMA表达与传代代数呈正相关（r=0.456，P=0.002）；角蛋白18表达高密度组较低密度组强（t=2.591，P=0.027）；而αSMA表达高密度组较低密度组弱（t=2.938，P=0.015）。
结论：HRPE细胞体外培养转分化主要是体内外环境差异引起。
【关键词】 人类视网膜色素上皮细胞；细胞培养；转分化现象
ured in vitro
MaoSong Xie, GuoXing Xu, Qiong Li, Jian Guo, YueLan Feng
Foundation items: Joint Tackling Problem Foundation of Ministry of Health of the Peoples Republic of China (No. WKJ20052013); Sponsored by “Excellent Programs” Topic Funds for Returned Overseas Chinese Scholars, Ministry of Personnel of PRC（No. GR2006FJ1）
Fujian Institution of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China
Abstract
AIM: To investigate the transdifferentiation of human retinal pigment epithelium (HRPE) cultured in vitro.
METHODS: The cellular morphology of HRPE was observed by invert microscope and the expressions of keratin and αsmooth muscle actin were detected by immunocytochemistry stain.
RESULTS: During routine culture on tissue culture plastic, HRPE lost epithelial characteristics and acquired a mesenchymal celllike phenotype. The cells transdifferentiated when continued passage in vitro. This correlated with the loss of the epithelial morphology, decreased expression of the epithelial marker cytokeratin 18, redistribution of the actin cytoskeleton and de novo expression of αsmooth muscle actin. The expression of cytokeratin 18 was negative correlation with continued passage (r=0.831, P<0.001) and that of αsmooth muscle actin was positive correlation with continued passage(r=0.456,P=0.002). The expression of cytokeratin 18 in high density group was stronger than that in low density group (t=2.591, P=0.027). The expression of αsmooth muscle actin in high density group was weaker than that in low density group (t=2.938, P=0.015).
CONCLUSION: The morpholigic and behavioral transdifferentiation of HRPE cells cultured in vitro are influenced by the differentia of external environment between in vivo and in vitro.
KEYWORDS: human retinal pigment epithelium; cell culture; transdifferentiation
0引言
人类视网膜色素上皮细胞（human retinal pigment epithelium，HRPE）是一种高分化的细胞，其分化特性的维持依赖于适合的外界环境。外界环境改变如体外培养及在一些病理状态下，HRPE细胞可发生一系列的变化，成为间质样细胞[1]。这过程被称为HRPE细胞的转分化现象[2]。我们观察HRPE细胞体外培养时的形态改变和角蛋白及α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，αSMA）的表达变化，为今后进一步维持体外培养HRPE细胞的分化特性和深入研究病理性增生性玻璃体视网膜疾病的发病机制奠定实验基础。
1材料和方法
1.1材料 角膜移植供体的健康成人眼球。美国Forma CO2培养箱、苏州产超净工作台、日本Olympus倒置相差显微镜、北京精利LCZ52型低温自动平衡离心机、日本Olympus PMCB20摄影器材，HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统。DMEM/F12培养基、胎牛血清、小牛血清、胰蛋白酶EDTA（Gibco公司）、鼠抗人角蛋白18mAb鼠抗人αSMA mAb，鼠二步法试剂盒（北京中杉公司）。
1.2方法 HRPE细胞的取材和原代、传代培养参照Xu等[3]报告的方法。用倒置显微镜观察HRPE细胞形态，记录并拍照。HRPE细胞的角蛋白18和αSMA免疫细胞化学染色采用免疫组化Envision二步法，取出细胞爬片，PBS冲洗后40g/L多聚甲醛固定15min；PBS冲洗后加入10g/L Triton破膜10min；PBS冲洗后加入30g/L H2O2灭活内源性过氧化物酶活性15min；PBS冲洗后羊血清封闭10min；一抗（鼠抗人角蛋白18mAb 1∶300稀释、鼠抗人α平滑肌肌动蛋白mAb1∶100稀释）37℃湿盒孵育80min；PBS冲洗后二抗37℃湿盒孵育20min；PBS冲洗后DAB显色6min，苏木素复染，中性树胶封片。镜下观察，采用HPIAS2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统对角蛋白18和αSMA的表达进行半定量分析，每个标本随机选取5个不重叠的高倍镜视野（×400），测定每个视野下阳性反应的光密度，以每5个视野光密度的平均值作为该例的测量值。原代及传代（1∶3传代，第1，2，3，4，5，6代）细胞爬片进行角蛋白18，αSMA免疫细胞化学染色。为确定转分化的细胞是HRPE细胞而非污染其他细胞，取第2代HRPE细胞接种爬片培养2d后，选择分化较好的HRPE细胞克隆，用灭菌橡胶刮从克隆中间线性刮除部分细胞，再培养3d后进行角蛋白、αSMA免疫细胞化学染色。为研究是体外培养环境还是体外培养时间对HRPE转分化起主要作用，取第1代HRPE细胞分2组，分别按2×105（高密度组）和5×104（低密度组）接种，分别于2wk后细胞爬片进行角蛋白、αSMA免疫细胞化学染色。
统计学处理：各组数据均采用±s表示，数据采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，体外传代培养时HRPE细胞角蛋白和αSMA采用Pearson相关分析。不同密度培养HRPE细胞角蛋白和αSMA采用t检验。P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1 HRPE细胞形态学 原代细胞分化良好，呈五角或六角形，细胞内色素颗粒偏向细胞一侧，仍维持一定的细胞极性，与体内HRPE细胞形态相似。转分化的细胞变得更为扁平，按一定方向生长，细胞融合时呈梭长形，类似间质样细胞，转分化严重的细胞细胞变大呈不规则形状，可见细胞骨架形成的张力丝，细胞融合时部分细胞失去接触抑制而重叠在一起。
2.2角蛋白和αSMA表达 HRPE细胞体外培养时角蛋白18表达逐渐减弱，角蛋白表达与传代代数呈负相关（r=0.831，P<0.001）。αSMA逐渐增强，αSMA表达与传代代数呈正相关（r=0.456，P=0.002，图1）。HRPE细胞克隆中角蛋白18表达强度从克隆中心向外周由强逐渐减弱，而αSMA多表达在克隆的外周；分化较好细胞克隆刮痕边缘的细胞增殖向刮痕生长迁移，细胞越接近刮痕角蛋白18表达越弱，αSMA多表达在刮痕的边缘，且其排列方向与其迁移方向平行（图2）。角蛋白18表达高密度组较低密度组强，两组间差异有显著性意义（t=2.591，P=0.027）；而αSMA表达高密度组较低密度组弱，两组间差异有显著性意义（t=2.938，P=0.015，图3）。
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