3讨论 尽管培养技术不断发展,当前人工模拟体内环境的技术已经很高,细胞在人工培养条件下可以相当好的生存、生长和增殖,但当组织细胞被置于体外培养后,失去神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡的环境中,日久天长,细胞形态和功能都会发生一定程度的改变,即体内、外细胞存在差异。细胞在体外培养时间越长,差异越大。体内、外细胞的差异关键在于细胞的分化。因此,细胞分化是检测细胞差异的核心问题。角蛋白多数情况下表达于各种上皮组织和上皮细胞,是细胞结构的一种重要组成成分[4],可作为HRPE细胞维持上皮细胞特征的分化指标。αSMA是一个肌细胞分化的标志,正常表达在平滑肌和心肌细胞,是细胞的一种收缩成分,在正常HRPE细胞中不表达,但在体外培养及在一些病理状态下转分化的HRPE细胞则有表达,可作为HRPE细胞转分化为间质样细胞特征的分化指标[5]。
图1各代HRPE细胞的角蛋白和αSMA表达变化(略)
细胞的分化机制极其复杂,是细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下,由众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。人体细胞与细胞及胞外基质之间通过神经内分泌系统保持着高度的相互依存,通过相关基因的调控使之发生增殖或分化。当细胞离体培养后失去上述体内联系,特定的分化基因表达减弱或停止,遂使体内外细胞出现差异[68]。实际上这种差异从细胞离体培养的瞬间就开始了。体外培养细胞分化变化表现为:(1)不适应,即细胞失去原有组织结构和细胞形态,分化减弱或不显,是由于环境的改变而出现的变化;(2)脱分化或去分化,即细胞失掉发生分化的能力,可能是基因变异所致[9,10]。HRPE细胞体外培养时可发生不适应现象如细胞形态由上皮细胞形态转变为间质样细胞形态,角蛋白表达逐渐减弱。HRPE细胞在体外培养或病理性状态时可发生转分化现象如可激活基因,从而表达其原先不表达的αSMA。 体外环境与体内条件越相近时,细胞越容易保持分化特性;反之则细胞越难保持分化特性。这可由不同密度接种HRPE细胞的角蛋白和αSMA的表达变化得到证实。角蛋白18表达高密度组较低密度组强,而αSMA表达高密度组较低密度组弱。因此有必要努力创造条件以模仿体内的环境进行HRPE细胞培养,如双腔共培养体系、以明胶为基底膜的培养体系、以羊膜为基底膜的培养体系及以微球为载体的培养体系等。体外培养细胞时接种密度不宜太低以维持细胞间的联系。HRPE细胞转分化现象不仅在体外培养时出现,HRPE细胞在病理状态下增殖时也可发生。视网膜前膜和牵引性视网膜脱离的牵引条索中可以检测到αSMA的表达,提示当眼内发生病理改变时,HRPE细胞可以迁移进入玻璃体腔,细胞上皮特性减弱或丧失,细胞骨架肌动蛋白重分布,继而转分化表达αSMA而具有收缩能力,从而在病理性增生性玻璃体视网膜疾病中起重要作用[2]。所以HRPE细胞体外培养转分化主要是体内外环境差异引起,应用培养的HRPE进行移植时应对细胞进行检测,不宜使用已经去分化或转分化的细胞进行移植。HRPE细胞在病理性状态下发生转分化可能在增生性玻璃体视网膜疾病中起重要作用。
图2HRPE细胞角蛋白和αSMA表达(略)
A:角蛋白×400;B,C:αSMA×100
图3HRPE细胞角蛋白和αSMA的表达(略)
均有aP<0.05 vs高密度
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