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3讨论
目前，建立CNV动物模型的方法繁多，主要有激光诱导、生长因子诱导、炎症诱导、缺氧诱导、氧化损伤诱导和手术诱导的在体动物模型及脉络膜植片体外培养的离体动物模型。这些动物模型各有其优缺点，但尚无一种模型可以完全模拟人类CNV的发展过程[1,2]。通过高能量激光光凝视网膜，随后发生损伤修复反应，光凝区内CNV形成，是目前国内外普遍使用的CNV动物模型，经常用于观察血管生长因子的表达水平、研究基因敲除特异性基因的作用、评价抑制剂和药物以及光动力疗法等对CNV的治疗效果等[35]。但是，激光器的种类不同，使用的参数亦有不同。既往曾有人使用氪激光（647nm），参数为光斑能量输出功率250mW，直径50μm，曝光时间0.05s，在距视盘1.5～2.0PD处，避开血管，环绕视盘光凝1排10点成功诱发出小鼠CNV模型[1]，本实验考虑到大鼠视网膜面积较小鼠大、视网膜神经纤维层厚度较小鼠厚，将原参数光斑能量输出由250mW更改为360mW，将原光凝10点改为环绕视盘光凝2排（20点）亦成功诱发出BN大鼠的CNV模型，该模型同其他激光器诱发出的CNV大鼠模型在FFA渗漏发生、CNV厚度变化等情况一致[6]，可以作为理想的动物模型做进一步的中药干预观察研究；而且该模型在7d后即有CNV形成，渗漏高峰在14～28d，成模速度快、维持时间较长且稳定，且该模型将激光点数增加，使样本量加倍，更有利于病理切片的制备，更利于相关指标的测算。观察评价CNV的方法主要有活体的影像学检查和组织病理学检查。活体的影像学检查主要有FFA、吲哚氰绿血管造影（ICGA）、光学相干断层扫描（OCT）观察等。FFA是用来动态监测CNV形成过程的主要手段，是较组织学方法快速和简便的观察手段。新生血管在造影早期就出现荧光，晚期伴有荧光素渗漏，根据荧光素渗漏程度可判断CNV形成的大小。ICGA与FFA显示的CNV病变部位一致，对黑色素、出血及渗出物的穿透力更强，但荧光效应弱，为荧光素钠的1/25，显示的图像没有FFA清晰，故本文仅选择了FFA作为观察CNV的指标，但应注意FFA上的荧光渗漏与真正的血管渗漏之间的关系不清楚，只能作为间接反映CNV渗漏的指标，组织学方法才是判断CNV形成的“金标准”。OCT检查由于鼠眼较小，操作困难，故未采用。FITC右旋糖酐标记CNV的技术原理为高相对分子量的FITC右旋糖酐（2×106）固定后能滞留在血管内，FITC可被激光激发表现出绿色荧光从而标记出CNV，该方法可以成功标记缺氧诱导的鼠血管增生性视网膜病变模型中视网膜铺片上的新生血管[7]。后来，这种方法被Edelman等[3]证实，可以用于评估CNV。但是，在我们的实验中发现该方法不稳定，有的图片可以清晰辨认CNV（图4B），有的图片在光凝斑处未见到CNV，却有明显的背景荧光遮蔽（可能是光凝造成的组织损伤形成的脂褐素样物质发出的自发荧光造成的），因此，CNV的面积测量不够准确，在实验中仅将其作为一形态学指标加以描述，未计入统计学分析。组织学方法需要大样本，可以利用光镜、电镜、荧光显微镜及共聚焦显微镜从不同水平观察。我们选择HE染色大体观察CNV的大小，通过每眼连续切片中直径最大和中央厚度最大的切片作为对该眼CNV评价的指标，经统计分析与杨秀梅等[8]的结果一致，说明该动物模型具有良好的可重复性，而且，进一步通过Ⅷ因子抗原标记血管内皮细胞，证实确有CNV形成，下一步拟通过大样本Ⅷ因子抗原标记物的累积光密度分析看CNV的密度变化情况。我们发现，尽管28d与7，14d相比，FFA渗漏面积和CNV厚度无统计学差异，但与其他学者[6,8]的研究结果不一致，28d已经表现出下降的趋势，考虑与光凝20点后诱发更为强烈的损伤反应，使随后的愈合反应加速进行有关。因此，为避免自发的创伤愈合反应对实验结果的影响，我们将观察周期截止至28d。
总之，氪激光诱导的BN大鼠模型是一有效的CNV模型，Ⅷ因子抗原可以作为CNV存在的有效指标，可以通过FFA和CNV厚度等指标对CNV生长变化做进一步的定量分析，因此，可以利用该模型研究药物对CNV的作用，为今后临床应用治疗CNV提供依据。
【参考文献】
1王雨生.脉络膜新生血管性疾病.北京：人民卫生出版社 2007：160175
2 Jiang W, Chiou GCY. The development of agerelated maculardegeneration (AMD)experimental models. Int J Ophthalmol 2007；7(3)：585589
3 Edelman JL, Castro M. Quantitative image analysis of laserinduced choroidal neovascularization in rat. Exp Eye Res 2000；71(5)：523533
4 Zhang H, Liu ZL. Suppression of experimental choroidal neovaseularization utilizing antiFLK1 monoclonal antibody. Int J Ophthalmol 2007；7(4)：891894
5 Xu JF, Wang YS. Review of glucocorticoid and diseases with choroidal neovascularization. Int J Ophthalmol 2007；7(3)：772775
6何花，张红，赵春明，等．激光诱导的实验性脉络膜新生血管模型的定量研究．眼科研究2007；25（1）：1822
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