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3讨论
在以往很长的一段时间内,我们对人体角膜的微观结构完全依赖于尸体角膜的组织学手段。但是,由于尸体角膜来源紧张,数量稀少,并且无法做到动态连续观察,对角膜组织学的认识长期以来无法得到突破,而对角膜组织结构进行活体的动态观察也成为了眼科医学界长期追求的一个目标。随着海德堡HRTII激光共焦显微镜的问世，就为我们提供了这样一个实时、活体、清晰、无创的检查方法。激光共焦显微镜利用激光为光源，可在活体上对角膜进行三维立体扫描，提供清晰的活体角膜的病理学改变依据，与传统的光学显微镜相比，它具有以下优点：(1) 由于激光特有的单色性和相干性[5],图像清晰 ,将分辨率提高至1μm；(2)可以对病变进行确切的深度定位 ,可重复操作,利于疾病的随访和病变的前后对比；（3）独特的纵向断层扫描实现了对角膜病变的多层次立体观察 ,达到了类似组织切片的效果；（4）提供多种图像获取模式 ,可同时获取横向和纵向的扫描图像，达到三维立体的效果。
利用激光角膜共焦显微镜，我们可以获得清晰的角膜各层组织学图像，并对角膜细胞密度进行计数和分析。其中，上皮细胞随着深度的加深，细胞表现出体积变小，数量增多的特点，到上皮基底层，细胞数达到了最多，体积最小，但细胞核的体积并无类似的改变，因此，与表层细胞相比，基底层的细胞核更容易窥见。Bowman膜无细胞结构，其特征为层间分布有大量神经纤维。基质层是角膜最厚的一层，从所获得的基质层图像上，我们发现，它表现为较为规则的板层网状结构，这种网状结构从前到后表现出细胞密度逐渐减小，网状结构逐渐疏松，“网眼”逐渐增大的特点。与其他角膜结构相比，Descemet膜更多的表现为一个三层结构的移行带，这可能是因为它本身很薄，并且与后基质层和内皮层相嵌有关。内皮细胞和上皮细胞一样，排列非常紧密。细胞呈六边形结构，体积较上皮细胞大，偶然可见内皮细胞核的低反光暗区。从上皮基底层开始，我们就可以在层间看到角膜神经的出现。相比之下，基质层的神经纤维分布较散在，但表现为较粗大，而在向角膜浅层的走行过程中，角膜神经纤维逐渐分支，直径减小，密度增高。在Bowman膜纤细的神经纤维相互交织成网状结构，其末梢指向上皮层。对于角膜细胞密度的改变，一直以来都存在很多争论。激光共焦显微镜所自带的Rostock操作软件能对角膜细胞进行直接计算,从而能为这种争论提供最直接、最可靠的依据。从本实验中，我们可以看到，在不同年龄组中，角膜细胞密度存在着类似的改变：上皮基底层细胞与表层细胞相比，其密度有明显的增加；基质层细胞随深度的增加，也表现出细胞密度逐渐降低的趋势；>60岁组的内皮细胞密度与<20岁组相比有减少,存在统计学差异。在谢立信等[6]的相关文献报道中，也有相同的研究结果。但是，在Niederer等[7]的报道中，认为随着年龄的增加，角膜各层细胞密度均有下降。在本实验中，虽然也表现出类似的趋势，但这种差异并不具有统计学意义，考虑原因，可能和人群中角膜细胞密度的变异性较大，同时缺乏长期连续的动态观察结果有一定关系。
但是，我们必须认识到，在本研究中 ,我们仅仅对受检者的中央角膜做了局部观察,而对于旁中央区的角膜各层的差异并无观察对比。同时由于观察时间较短，对受试对象角膜结构的长期观察仍需要进一步的研究。虽然目前我们已能获得比较清晰的角膜组织学图像，但是目前的技术尚不能达到对角膜进行三维重建的程度，因此，对整体角膜的微观认识，仍需眼科医师和医学工程师的共同努力。
【参考文献】
1 Minsky M. Memoir on inventing the confocal scanning microscope scanning. Scanning1988; 10:128
2 Cavanagh HD, Shields W, Jester JV, et al. Confocal microscopy of the living eye. CLAO J1990;16(1):6573
3 Cavanagh HD, Petroll WM, Alizadeh H, et al. Clinical and diagnostic use of in vivo confocalmicroscopy in patientswith corneal disease. Ophthalmology1993;100(10):14441454
4 Mustonen RK, Mcdonald MB, Srivannaboon S, et al. Normal human corneal populations evaluated by in vivo scanning slit confocal microscopy. Cornea1998;17(5):485 492
5 KobayashiA, Yoshita T, Sugiyama K. Whitelight and laser confocal microscopic findings of rabbit conjunctiva. Ophthalmic Surg Las Imaging 2004;35(2):146148
6谢立信,史伟云,郭萍. 正常人活体角膜组织结构的共焦显微镜观察. 中华眼科杂志 2000;36(3):235237
7 Niederer RL, Perumal D, Sherwin T, et al. Agerelated differences in the normal human cornea: a laser scanning in vivo confocal microscopy study. Br J Ophthalmol2007;91(9):11651169
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