图3视网膜外核层明显可见K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×18 000

    K-NPPase酶组化孵育液的配制需严格遵循Mayahara等[7]开发的K-NPPase酶组织化学方法。其pH值要求很高，只有在pH＝8.8～9.0时K-NPPase活性才能显示出来。孵育液中加入左旋咪唑是为了抑制其他非特异性碱性磷酸酶活性，加入DMSO可以增强K-NPPase的活性，加入枸橼酸铅捕捉剂可以与Na+,K+-ATPase水解ATP后释放的游离磷酸根离子发生沉淀反应。固定液采用了40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液（含60g/L蔗糖），可以使K-NPPase在足够长的时间内（＜1h）不失活，而同样含NPPase的Mg2+-ATPase在此固定条件下则完全失活，由此排除了Mg2+-ATPase反应颗粒对本实验的影响。K-NPPase酶组化电镜染色与其他电镜染色不同之处在于未加入枸橼酸铅，而只用醋酸双氧铀进行染色，目的是为了能分辨出细胞膜表面的K-NPPase，但缺点是未能使细胞器及细胞核膜等进一步着染。

    我们通过Metamorph/DP10/BX51系统，对每张电镜照片的标尺进行换算后，测量相邻K-NPPase颗粒间距离。在数据采集的过程中，为了避免细胞膜重叠所造成的误差，我们选取了RPE与视杆细胞外节（ROS）衔接的部位，由于光感受器外节无Na+，K+-ATPase[10]，如本实验所观察到的（图3），可以认为与ROS相衔接的RPE细胞顶端微绒毛膜上的K-NPPase颗粒皆为RPE细胞所有；而为了避免IPE细胞之间紧密接触部位计数时对双层细胞膜表面的K-NPPase颗粒重叠计量所造成的误差，测量时选取了IPE游离的微绒毛表面的K-NPPase颗粒；另外，据记载RPE顶端与ROS衔接的部位Na+，K+-ATPase的密度较高（图4）[9]，因此特别选取该部位与IPE进行比较。尽管在不同的放大倍率下得到的组间的平均距离变异系数稳定(24.79±1.02)，但为了消除放大倍率不同所可能产生的系统误差，所有被采集照片放大倍率仍被限定为35 000倍。值得注意的是，在电镜观察过程中[11]，可以发现有色素组的IPE或RPE细胞质内色素小体的膜上有成行排列的K-NPPase颗粒，本结果中IPE（或RPE）的有色素组与无色素组K-NPPase颗粒距离的差异有非常显著性意义（P＜0.001）。故我们推测这种差异可能与细胞质内含有色素颗粒的多少有关。

    图4 ①黑色素颗粒；②视杆细胞外节盘膜；③RPE细胞层；④脉络膜血管腔；⑤RBC；⑥Bruch膜构成完整的光感受器复合体，进一步放大可见RPE顶端具有K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色×27 500

    在本实验中，有色素组的IPE组与RPE组的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2）；无色素组的IPE组与RPE组的差异有非常显著性意义（P＜0.001）；有色素组和无色素组汇总后的IPE细胞膜上的K-NPPase酶颗粒的距离平均值40.16±1.19nm，RPE细胞顶端微绒毛膜上K-NPPase颗粒的距离平均值为41.07±1.78nm，二者的差异无显著性意义（0.5＞P＞0.2）。由此可以推知IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的密度与RPE顶端的微绒毛膜上的密度相近，也就是Na+，K+-ATPase的密度相近，故推测兔眼IPE细胞与RPE细胞具有相似的物质转运功能。我们通过对兔眼IPE细胞和RPE细胞物质转运功能的量化比较研究，初步证明了IPE细胞完全可能代替RPE细胞在视网膜下腔发挥物质转运功能，重建光感受器复合体的结构与功能。结合以前的相关报道，IPE细胞与RPE细胞生理功能的很多相似之处。相信，随着研究的进一步深入和我们对IPE和RPE细胞生理功能认识的加深及IPE细胞培养技术的成熟和玻璃体视网膜手术的不断发展，自体IPE移植将有希望为ARMD患者带来光明。

    【参考文献】

    1李毅斌.虹膜色素上皮细胞的培养及移植.国外医学眼科学分册,1999;23(3):129-133

    2 Schraermeyer U, Kociok N, Heimann K. Rescue effects of IPE transplants in RCS rats: short-term results. Invest Ophthalmol Vis Sci ,1999;40(7):1545-1556

    3韩冰,徐强,朱荃,韩凌.周细胞条件培养液对视网膜色素上皮细胞,胶质细胞及巨噬细胞增殖的影响.国际眼科杂志,2004;4(5):829-830

    4刘洪雷,王雨生,刘军,惠延年.人视网膜微血管周细胞原代培养及鉴定.国际眼科杂志,2005;5(1):55-58

    5 Rezai KA , lappas A, Farrokh-siar L, kohen L, Wiedemann P, Heimann K. Iris pigment epithelial cells of long evans rats demonstrate phagocytic activity. Exp Eye Res ,1997;65(1):23-29

   6 Kociok N, Heppekausen H, Schraermeyer U, Esser P, Thumann G, Grisanti S, Heimann K. The mRNA expression of cytokines and their receptors in cultured iris pigment epithelial cells: a comparison with retinal pigment epithelial cells. Exp Eye Res ,1998;67(2):237-250

    7 Mayahara H, Fujimoto K, Ando T, Ogawa K. A new one-step method for the cytochemical localization of ouabain-sensitive, potassium-dependent p-nitrophenylphosphatase activity. Histochemistry ,1980;67(2):125-38

    8 Schraermeyer U,Enzmann V,Kohen L, Wiedemann P, Heimann K. Porcine iris pigment epithelial cells can take up retinal outer segments. Exp Eye Res ,1997;65(2):277-287

    9张承芬,主编.眼底病学.第1版.北京:人民卫生出版社,1998:1-4

    10周衍椒,张镜如.生理学.第3版.北京:人民卫生出版社,1991:354-355

    11韩静,惠延年,韩泉洪,王雨生,郭长梅.人视网膜色素上皮细胞在电场中定向移行的实验研究.国际眼科杂志,2004;4(6):998-1001

上一页  [1] [2]