作者:邵立功,黄湛,骆彦君 作者单位:人民解放军海军总医院海军战伤救治研究中心 眼科,北京 100037;2.北京大学医学部,北京 100083;3.河北复明眼科医院,河北 新集 052360
【摘要】 目的 动态观察和探讨视神经(optic nerve,ON)1/2损伤后视网膜神经节细胞(retinea gangling cells,RGCs)的轴树突及神经元自然再生和复合神经营养因子辅助ON再生的细胞生物学变化特征,以寻找ON不全损伤后修复再生的新途径。方法 ①实验采用成年猫共计40只,随机分4组:正常对照组、眼球后ON1/2切断组、ON1/2切断并定时眼玻璃体内注射生理盐水对照组和ON1/2切断并定时眼玻璃体内注射脑衍化神经因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)复合神经营养因子辅助再生组。②动物模型制作以眶外侧入路手术开眶,暴露眼球后ON,在球后5 mm处准确行ON1/2切断。术后4组动物在相同视环境中饲养1、4和8个月,ON1/2切断并于玻璃体内注射BDNF和CNTF辅助再生组在术后即日注射BDNF和CNTF复合液(10 ng),并在以后每周注射等量BDNF和CNTF复合液2次。在ON损伤后1、4个月和8~12个月,3次行图形视觉诱发电位(pattern reversed visual evoked patential,PVEP)动态检测,然后将实验动物处死,灌注、固定、取材:切取眼球后ON和外侧膝状体(lateral geniculate nucleus,LGN)做组织细胞化学处理,数据经t检验处理。结果 ①ON横截面纤维(RGCs轴突)计数比较:a、ON1/2切断并定时于玻璃体内注射BDNF和CNTF复合因子组ON轴突数[(2.30±0.84)×105]与球后ON1/2切断组眼ON轴突数[(1.10±0.46)×105]比较,差异具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。b、ON1/2切断并定时于玻璃体内注射BDNF和CNTF复合因子辅助再生组眼ON轴突数目增多与ON1/2切断并定时于玻璃体内注射生理盐水对照组眼ON轴突数[(1.20±0.52)×105]比较,差异具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。②外侧膝状体由ON1/2切断并定时玻璃体内注射BDNF和CNTF复合因子眼输入层的神经节细胞计数(264.80±36.73)多于ON1/2切断组(147.80±18.56)和ON1/2切断并定时于玻璃体内注射生理盐水对照组眼输入层的神经节细胞计数(183.90±21.24),经统计学分析知,后两者差异具有非常显著的统计学意义(P均<0.01),进一步证实了由动态PVEP检测所得结果。结论 ON1/2损伤后复合神经营养因子辅助ON再生具有显著的拮抗损伤效应,BDNF和CNTF复合因子有拮抗损伤和辅助ON损伤后的修复和再生作用。
【关键词】 视神经损伤;再生;神经营养因子
视神经(optic nerve,ON)损伤后的修复与再生问题,一直是国内外神经科学和眼科学学者研究和探讨的一个重大课题,其神经病理、生理及分子神经生物学过程极为复杂,有诸多因素参与,ON损伤后的修复再生研究具有重要的理论和实践意义。临床上ON损伤患者一般都为不全损伤,因此我们拟在ON1/2损伤状态下,在视网膜神经节细胞(retinea gangling cells,RGCs)、ON和外侧膝状体(lateral geniculate nucleus,LGN)应用组织细胞化学技术处理,检测损伤眼LGN的神经节细胞形态和计数变化以及ON横截面的单位面积内的RGCs纤维形态和计数变化,从而探讨损伤眼ON纤维和LGN相应输入层的神经节细胞经复合型神经营养因子处理后是否有辅助神经元修复和再生的作用,其组织细胞学变化以及跨突触溃变行为和辅助再生的情况如何,以研究ON再生的可塑性效应机制。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 本实验采用普通成年猫共计40只,随机分为4组:①正常对照组(normal group,N)。②球后ON1/2切断组(ON1/2 incision group,ON1/2 I)。③ON1/2切断并定时玻璃体内注射生理盐水对照组(ON1/2 incision and injection physiological saline group,ON1/2 I+PS)。④ON1/2切断并定时于玻璃体内注射脑衍化神经因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)复合因子辅助再生组(ON1/2 incision and injection ciliary neurotrophic factor and brain-derived neurotrophic factor group,ON1/2 I+BF)。
1.1.2 实验试剂 ①试剂:尼氏(Nissl)染色试剂为焦油紫(Kresylechtviolet),固蓝(Fast Blue)由Leipzig化学公司提供。BDNF和CNTF生物制品由Regenron Phrmaceuticals of NY公司提供。②主要仪器:图形视觉诱发电位(pattern reversed visual evoked patential,PVEP)动态检测仪,冰冻切片机、CQ-970型计算机图像分析仪、Leica双目自动照像显微镜、脑立体定位仪等。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制作方法 以眶外侧入路方法手术开眶,暴露术眼球后ON,在眼球后5 mm处应用宝石卡尺手术刀准确行ON的1/2切断。术后4组动物在正常视环境中共同饲养1、4和8~12个月, ON1/2切断并于玻璃体内注射BDNF和CNTF辅助再生组在术后即日注射BDNF和CNTF复合液(10 ng),并在以后每周注射BDNF和CNTF复合液2次。在ON损伤后第1、第4和第8个月时,3次行PVEP动态检测,然后将动物处死,切取眼、视神经和外侧膝状体做组织学处理。
1.2.2 实验动物灌注固定和取材 实验动物在饲养到第1、第4和第8个月时,进行PVEP检测[1],在视觉电生理实验后分批灌注固定实验猫并快速取材。①动物麻醉后行开胸并剪开心包膜,右心室切开放出心血管系统血液,快速切开左心室并经左心室主动脉插管灌注生理盐水冲洗心血管系统,接着快灌注4℃冷固定液(4%多聚甲醛磷酸缓冲液,pH值为7.2),再慢灌注1000 ml含4%多聚甲醛、0.5%戊二醛和0.2%苦味酸的4℃磷酸缓冲溶液(pH值为7.2) 2 h。在4℃冰箱放置过夜后,标本块转至15%蔗糖溶液(PBS pH值为7.2)中浸泡12 h,待标本块下沉后由液氮速冻后行切片。②标本取材顺序为:a、眼球后2~4 mm处切取视神经。b、冠状切取同侧和对侧LGN组织。c、ON横截面行Fast Blue染色程序,LGN行冠状切片并行Nissl染色。d、酒精梯度脱水,Hemo-De透明,DPX封固。e、在光镜下观察计算机图像。
1.2.3 图像分析组织学结果 组织细胞化学结果分析程序:参照细胞构筑学特点,将4组内每只幼猫同侧和对侧LGN冠状切面平铺片各取5张,每张组织切片选取5个视野计数,在QTM970型图像分析仪的10×40倍光镜视野下,测量上述解剖部位单位面积内的神经元数密度(numberical density,ND),数密度用染色阳性细胞数/视野内面积表示。ON横切面轴突纤维计数采用ON横切面分区法:首先,将ON横切断面组织切片在放大20倍的光镜下进行分区,共计分成8个区。在ON最大直径处划一条水平直线,在水平直线中点划一条与其垂直的纵行直线。然后,通过中心作与水平直线成45°角的两条斜线,此将ON横切面分为8个区,在每一区内随机选4个视野计算单位视野面积(mm2)内的ON轴突数量。每一ON横切断面的RGCs轴突总数为8个分区单位视野面积(mm2)内的ON轴突数量的均数计数之和,每个实验组共计数10张ON横切断面组织片, 按上述ON横切断面组织片分区法测量其单位面积内的ON纤维数ND。
1.2.4 统计学方法 应用t检验进行统计学分析。
2 结果
2.1 各实验组ON横断切面组织片形态学变化与RGCs轴突计数 ON横断面切片经固蓝(Fast Blue)染色后暴露了典型的RGCs轴突纤维解剖学特征,ON轴突成束被神经束膜包裹,每一束的ON轴突数量不等,ON轴突由髓鞘包绕,髓鞘周围为少突胶质细胞。髓鞘被染成蓝黑色,其他组织被染成蓝紫色, 球后ON1/2切断组和ON1/2切断并定时于球后注射生理盐水对照组ON轴突横断面切片,可见有明显轴树突溃变后的脱髓鞘和结缔组织瘢痕形成;而ON1/2切断并定时于玻璃体内注射BDNF和CNTF复合因子辅助再生组ON轴突横断面切片,则可见轴树突溃变与脱髓鞘和结缔组织瘢痕形成较弱(见图1~图3)。各组实验眼ON横断面切片计数(mean number of axons/10 section)经t检验分析,统计结果见表1。ON1/2 I+BF组的 ON轴突数与各组比较,差异具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。
2.2 外侧膝状体冠状切片实验眼相应输入层神经节细胞计数 Nissl染色后,在光学显微镜下(见图4~图6)正常对照组LGN冠状切片,分三层,即A、A1和C层。大小神经节细胞均被染成紫蓝色,细胞核浓染。在A和A1层的大小神经节细胞分布均匀,未见细胞缺失现象。而在球后ON1/2切断组和ON1/2切断并定时于玻璃体内注射生理盐水对照组实验眼,LGN相应输入层的神经节细胞有缺失现象,细胞体有皱缩及胞浆内尼氏小体固缩减少,出现神经元跨神经节溃变现象。在ON1/2切断并定时于玻璃体内注射BDNF和CNTF复合因子辅助再生组实验眼,LGN相应输入层的神经节细胞也出现了不同程度的退变现象。具体见表2。ON1/2 I+BF组的LGN相应输入层的神经节细胞计数与各组比较,差异具有非常显著的统计学意义(P<0.01)。
3 讨论
视网膜RGCs的ON横截面轴突计数和LGN实验眼相应输入层神经节细胞计数是计量研究视神经损伤后修复和再生的组织化学方法。本实验以ON1/2损伤作为观察RGCs轴突损伤后修复再生的模型,并在损伤眼玻璃体内定时注射BDNF和CNTF辅助ON轴突的修复和再生,通过在视网膜RGCs的ON横截面轴突计数和LGN实验眼相应输入层神经节细胞计数行1/2损伤后的ON再生计量学研究。当成年哺乳类动物视神经完全(截断或挤压)损伤后,其RGCs可引起严重丢失,大约占全部细胞的50%到90%,RGCs轴突和胞体的溃变及LGN神经节细胞的跨神经节还取决于ON损伤的类型、损伤的严重程度以及损伤时的动物年龄[1-6]。我们的结果显示,在ON1/2损伤后,神经元自然死亡和再生并行,自然死亡成分大于再生成分,这与上述结果相符。而由外源性BDNF和CNTF复合神经营养因子行玻璃体内定时注射则具有拮抗损伤效应和互补辅助修复和再生作用,与ON1/2损伤后神经元自然死亡和再生比较,明显地增强了拮抗损伤和RGCs轴突自我修复和再生的能力,但与正常对照比较仅为部分恢复,即还没有达到完全修复和再生的目的。尽管外源性BDNF和CNTF复合神经营养因子对损伤的ON作用还不完善,但其拮抗损伤和辅助再生作用是不容忽视的[7-11]。内源性神经营养因子在神经损伤与再生中的地位和作用,主要是集中在损伤轴突的远侧端[12-14],如果在损伤轴突的近侧端施加复合性神经营养因子则有助于损伤视神经的修复和再生。
某些实验结果证明:①实施外源性复合性神经营养因子拮抗损伤和辅助再生作用要强于单一神经营养因子作用。②神经营养因子的拮抗损伤和辅助再生作用发生在损伤的RGCs轴突与LGN目标神经元建立突触联系前。另外,总结本实验结果和前人的经验,可以认定在ON损伤后如何降低RGCs的死亡百分比是至关重要的。ON损伤后自然再生未成功可能原因有:①损伤类型和损伤的严重程度。②损伤时的动物年龄。③RGCs轴突损伤后的顺向和逆向信号通过损伤点的延迟和不能[15-16]。④损伤点局部的微环境的变化。⑤损伤后的分子神经生物学模式和神经营养模式的变化。⑥死亡基因启动和细胞程序性死亡(凋亡)[17-18]。而神经营养模式变化和死亡基因及死亡抑制基因(ball lymphomal lewkmina-2,bcl-2)之间的相互制约决定了损伤后神经元的生存趋向。例如bcl-2也称程序性细胞死亡凋节因子, 在视觉系统bcl-2可调节神经元的生存并介导神经营养因子(neurotrophins,NTs)的神经营养保护作用。这种现象在动物体内实验及感觉神经元的细胞培养中均能表现出来[19]。实验证实,bcl-2缺陷小鼠在出生时其交感、感觉和运动神经元的数量没有明显改变, 并且通过BDNF或CNTF可防止退变。Allsopp等[20]经实验发现,BDNF对神经系统细胞的营养生存作用需要bcl-2参与,因为外源应用抗bcl-2 mRNA抗体后,虽然外源提供了BDNF但也不能阻止神经元的死亡,神经元死亡至少有两条途径, 这可分为它们对bcl-2敏感性和依赖内源性和外源性NTs的作用以及环境因素等。而外源性提供BDNF和CNTF眼玻璃体内定时注射为拮抗损伤和辅助ON再生带来了希望。当然,除了上述所讨论到的影响损伤后的RGCs轴突再生因素外,阻滞损伤后的RGCs轴突再生原因也是复合性的,如NTs的促再生作用与再生抑制因子的逆向作用等等[21-25],此还有待于进一步经实验论证。
本实验从视网膜RGCs的ON横截面轴突计数和LGN实验眼相应输入层神经节细胞计数计量研究角度,观察、分析并论证了施加玻璃体内定时注射BDNF和CNTF复合神经营养因子对于辅助ON1/2损伤后修复再生的作用,为观察RGCs轴突损伤后修复再生的模型给ON的修复和再生奠定了组织形态学基础。提示BDNF和CNTF复合神经营养因子于玻璃体内定时注射具有拮抗损伤效应和互补辅助修复和再生作用,与ON1/2损伤后神经元自然死亡和再生比较明显地增强了拮抗损伤和RGCs轴突自我修复和再生的能力。
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