作者：傅亚娜 作者单位：温州医学院眼视光学院，浙江 温州 325003
【摘要】 目的 研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）对人巩膜成纤维细胞的生长调控，进一步明确bFGF和TGF-β影响近视的作用部位及可能机制。方法 取角膜移植后的3只健康供体眼球，分离培养巩膜成纤维细胞并建立细胞系，取第3~5代生长良好的细胞，在培养液中分别加入1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml的bFGF以及0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml的TGF-β，两组均设空白对照。6 d后进行细胞计数，选用t-test进行统计分析。每株细胞重复3次，共重复3株细胞，观察bFGF和TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调控作用。结果 bFGF能明显促进人巩膜成纤维细胞的生长，随浓度增加呈明显剂量效应关系。bFGF大于10 ng/ml时（包括10 ng/ml），和无bFGF的正常培养液比较，差异具有显著性（P<0.05）。TGF-β能明显抑制人巩膜成纤维细胞的生长，抑制细胞生长的作用亦呈明显的剂量效应关系。TGF-β大于0.3 ng/ml时（包括0.3 ng/ml），和无TGF-β的正常培养液比较，差异具有显著性（P<0.05）。结论 本实验结果显示，bFGF对人巩膜成纤维细胞生长具有明显促进作用，而TGF-β则表现为明显抑制作用。进一步证实外源性bFGF和TGF-β可能作用于巩膜组织，并通过调控巩膜成纤维细胞的生长及巩膜细胞外基质合成代谢单独或协同作用参与巩膜重塑过程。
【关键词】 巩膜成纤维细胞 碱性成纤维细胞生长因子 化生长因子-β 近视
实验性近视研究发现，在近视诱导动物模型眼内，巩膜和视网膜组织的碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）含量和浓度都发生了改变，而给予一定浓度的bFGF和TGF-β能干预小鸡实验性近视的发生、发展[1-3]。上述结果表明，bFGF和TGF-β可能作为信号分子参与了近视的发生发展。
巩膜是与近视发生关系最为密切的眼组织，巩膜成纤维细胞是巩膜的主要细胞组成成分，也是近视发生的终级细胞。正常状态下，巩膜成纤维细胞分泌胶原等细胞外基质，共同构成眼球外壁，维持眼球组织的完整性并决定眼轴的长度[4]。我们前期研究发现，人巩膜成纤维细胞上存在bFGF最特异的一种受体亚型——FGFR-1和TGF-β最主要的两种受体亚型——TβRI和TβRII受体[5-7]。根据目前研究推断，在近视发生发展过程中，bFGF和TGF-β的作用部位可能就位于巩膜[8]，bFGF和TGF-β通过受体介导发挥生理功能。
但迄今为止，bFGF和TGF-β对人巩膜成纤维细胞的生长作用尚未明了，本实验在前期研究受体分布的基础上，进一步研究bFGF 和TGF-β对人巩膜成纤维细胞的生长调控，从而进一步明确bFGF 和TGF-β影响近视的作用部位及可能机制。
1 材料和方法
1.1 人眼巩膜成纤维细胞体外培养及鉴定[7] 本研究材料取自温州医学院附属医院角膜移植手术后的3个眼球剩余组织（自愿捐献眼球者，无系统及眼部疾病史，年龄在25~30岁）。眼球摘除后24 h内即做细胞培养，方法如下：无菌条件下分离巩膜组织，切成直径约1 mm×1 mm小块，培养液为DMEM（Dulbecco Modified Ealge’s Medium）加10%胎牛血清（Gibco，NY，USA），放入CO2自动调节培养箱（用含5% CO2和95%空气的湿润环境，37℃），逐日用倒置相差显微镜观察并补充培养液，细胞融合后用0.25%胰蛋白酶消化传代，建立巩膜成纤维细胞系。根据形态学特征及免疫组化染色进行鉴定。
1.2 bFGF对巩膜成纤维细胞的生长调控实验 取第3~5代生长良好的巩膜成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，获得细胞悬液。分别以同样的细胞量（2.5×104~3.0×104）接种于24皿板中，以加10%胎牛血清（Gibco，NY，USA）的DMEM培养24 h后，分别在培养液中加入1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml的bFGF（PeproTech，London），以不加bFGF的作为对照。每隔2 d换液，并加入相应浓度的bFGF，6 d后用0.25%胰蛋白酶消化各孔细胞，在细胞计数板上计出每孔细胞总数， 与对照组比较，以t-test 检验其差别之显著性。
每株细胞重复上述生长调控实验3次，共重复3株不同供体的细胞，以t-test 检验实验组与对照组细胞数差别之显著性。观察bFGF对巩膜成纤维细胞的生长调控作用。
1.3 TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调控实验 取第3~5代生长良好的巩膜成纤维细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，获得细胞悬液。分别以同样的细胞量（5.5×104~6.0×104）接种于24皿板中，以加10%胎牛血清（Gibco，NY，USA）的DMEM培养24 h后，分别在培养液中加入0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1 ng/ml、 3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml的TGF-β（PeproTech，London），以不加TGF-β的作为对照。每隔2 d换液，并加入相应浓度的TGF-β，6 d后用0.25%胰蛋白酶消化各孔细胞，在细胞计数板上计出每孔细胞总数，与对照组比较，以t-test检验其差别之显著性。
每株细胞重复上述生长调控实验3次，共重复3株不同供体的细胞，以t-test 检验实验组与对照组细胞数差别之显著性。观察TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调控作用。
2 结果
2.1 人巩膜成纤维细胞培养及鉴定 巩膜组织块一般都能在第2天贴皿，贴皿后3~4 d，巩膜块周边出现纤维状物质，大约在14 d左右，巩膜成纤维细胞开始自组织块边缘爬出，大多数细胞在爬出后24 h内贴壁，初起细胞为双极或纺锤型，近融合时细胞为典型的梭形，排列成致密的栅栏状。传代培养时细胞生长状态良好。免疫染色证实体外培养的巩膜成纤维细胞对角蛋白和S-100均表现阴性，表明我们培养的是巩膜成纤维细胞，无混杂细胞。
2.2 bFGF对巩膜成纤维细胞的生长调控作用 bFGF能明显促进人巩膜成纤维细胞的生长，1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、100 ng/ml、300 ng/ml浓度的bFGF，分别可达到135%、143%、182%、199%、237%、246%的促生长效果（见图1），促生长作用成明显的剂量效应关系。bFGF大于10 ng/ml时（包括10 ng/ml），可达成倍的促生长作用，和无bFGF的正常培养液比较，差异已具有显著性（P< 0.05）。
2.3 TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调控作用
TGF-β能明显抑制人巩膜成纤维细胞的生长， 0.1 ng/ml、0.3 ng/ml、1 ng/ml、3 ng/ml、10 ng/ml、 30 ng/ml浓度的TGF-β，分别可达到94%、92%、74%、59%、51%、32%的抑制效果（见图2），抑制细胞生长的作用成明显的剂量效应关系。TGF-β大于0.3 ng/ml时（包括0.3 ng/ml），和无TGF-β的正常培养液比较，差异已具有显著性（P<0.05）。
3 讨论
我们前期实验证实，人眼巩膜成纤维细胞表达bFGF和TGF-β的功能性受体[7]。本实验发现，bFGF对人巩膜成纤维细胞生长具有明显的促进作用，而TGF-β则表现为明显的抑制作用。以往关于bFGF和TGF-β对于不同种属的巩膜成纤维细胞的生长调控作用的研究结果，常出现不一致的结论，如Seko等[8]研究发现bFGF和TGF-β能刺激小鸡巩膜成软骨细胞和成纤维细胞的生长，而Hu等[9]研究发现TGF-β抑制人巩膜成纤维细胞的生长。本实验结果进一步明确bFGF 和TGF-β对人巩膜成纤维细胞的生长调控作用。出现不同的结果，可能是bFGF和TGF-β对巩膜成纤维细胞的生长调节作用具有种属差异。
小鸡近视模型研究发现，形觉剥夺2周后，巩膜组织内的bFGF含量和浓度与对照眼相比明显降低，而TGF-β则明显升高[1]。结膜下注射bFGF可抑制形觉剥夺性近视，且呈剂量依赖性，而联合应用TGF-β1使bFGF的抑制作用减弱[10]。bFGF和TGF-β分子量比较大，药物绝大部分可直接到达巩膜，说明巩膜可能是药物的直接作用部位。实验性近视研究提出近视发生的可能机制是：在异常的视觉环境中，视网膜上某些生物活性物质含量改变，最终作用于巩膜组织，使巩膜细胞外基质重新塑形，巩膜薄弱，眼轴异常生长，从而形成近视状态[4，9]。
目前研究已证实，bFGF和TGF-β是近视发生的两种信号分子，本实验进一步证实bFGF和TGF-β对人巩膜成纤维细胞的生长具有明显的调控作用，表明巩膜组织是bFGF和TGF-β的一个作用部位。联合应用TGF-β1减弱bFGF的作用，证实TGF-β与bFGF在近视发生发展过程中存在复杂的协同作用。对近视动物模型的形态学研究发现，其巩膜纤维层变薄，后极部巩膜胶原、蛋白多糖等含量明显减少，胶原纤维有超微结构的变化[11]。而bFGF和TGF-β的一个最重要的生理功能就是参与细胞外基质的代谢。因此可推测bFGF和TGF-β影响近视的可能机制为外源性bFGF和TGF-β与巩膜组织存在的特异性受体结合，通过调节巩膜细胞外基质的合成与降解，从而起到干预近视发生发展的作用。
本研究揭示bFGF和TGF-β对人巩膜成纤维细胞的生长具有明显的调控作用，更进一步证实外源性bFGF和TGF-β可能作用于巩膜组织，通过调控巩膜成纤维细胞的生长及巩膜细胞外基质合成代谢单独或协同作用参与巩膜重塑。在此基础上，全面、深入研究其对于巩膜细胞外基质合成和降解的机制，将为最终了解bFGF和TGF-β在近视中的作用奠定基础。
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