作者：任玫卿,栾洁
【关键词】 角膜； 上皮细胞； 原代细胞培养； 兔
角膜细胞成分培养是现代角膜病研究和治疗的基础，近年来，随着研究深入，对角膜细胞成分培养提出了更高要求。在此，我们探索了体外原代培养兔角膜上皮细胞的两种方法，以期建立一种简单、经济、实用的兔角膜上皮细胞培养方法，现将实验结果报告如下。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
健康新西兰白兔6只，雌雄不限，体重2.0～2.5 kg,由东南大学实验动物中心提供与饲养。眼部经裂隙灯显微镜检查显示屈光间质透明，无眼前节病变。
1.1.2 主要试剂和仪器
DMEM/F12（Gibco,USA)，胎牛血清（中美合资兰州民海生物），胰蛋白酶（Gibco,USA），EDTA（乙二胺四乙酸二钠，AMRESCO 分装），MTT（Sigma，USA），CO2培养箱（Heal Force HF121UV），倒置相差显微镜（OLYMPUS CKX41，Japan），酶标仪（Bio-rad Model 860）。
1.1.3 培养液的制备
采用DMEM/F12=1∶1的混合液，内含10 mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素和100×103 U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4。
1.2 实验方法
1.2.1 取材
取新西兰白兔6只，共12眼，以空气栓塞法处死兔，无菌条件下迅速摘取眼球，用PBS反复冲洗后浸泡于含青、链霉素1 000×103 U·L-1 4 ℃ PBS中10 min,待用。
1.2.2 消化法原代培养角膜上皮细胞
在超净工作台上将眼球用PBS冲洗2～3次，沿角膜缘取下完整角膜，用DMEM/F12培养液冲洗1～2次；在50 mm培养皿中加0.25%胰蛋白酶或0.1％胰蛋白酶－0.02％EDTA混合消化液约1 ml，将上述处理过的兔眼角膜上皮面朝下置于消化液中，培养箱中消化20～30 min后翻转角膜片，轻轻冲洗上皮面，将冲洗液移至加有适量胎牛血清的离心管终止消化；在培养皿中再次加入消化液，置培养箱中消化10 min后终止消化；将两次消化的细胞悬液离心6～8 min(1 000 r·min-1)，弃上清，加入全培养液（内含10 mmo1·L-1HEPES、20%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素、100×103 U·L-1链霉素，pH值7.2～7.4），吹打混匀。计数制成5×105～1×106 ml-1细胞悬液，接种于培养瓶中。置37 ℃、5%CO2 和95%空气培养箱中培养，3 d后首次换液，以后每周更换2～3次。
1.2.3 组织块贴壁法原代培养角膜上皮细胞
在超净工作台上，将眼球用PBS冲洗2～3次后沿角膜缘取下完整角膜，放入加有培养液的培养皿中；在体式显微镜下完整撕下角膜上皮面，剪成约1 mm3大小角膜上皮片，均匀平铺于培养瓶中，翻转培养瓶加入全培养液，置培养箱中培养2～4 h后轻轻翻转培养瓶，使培养液慢慢浸过组织块；或将角膜上皮片均匀平铺于24孔板中，置于培养箱中2～4 h，然后缓缓加入全培养液。将培养瓶或24孔板置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，3 d后首次换液，以后每周更换2～3次。
1.2.4 角膜上皮细胞的传代
原代培养至上皮细胞80％融合后用PBS冲洗2次，加入0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA 1 ml冲洗1次，再加入消化液1～2 ml，倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞变圆，细胞间隙变大或少量细胞脱壁时加入含血清的培养液终止消化，收集细胞悬液，离心6～8 min (1 000 r·min-1)，计数，接种于培养瓶中（按1∶2或1∶3传代），3 d后首次换液，以后每周更换2～3次，直至细胞融合。
1.2.5 观察方法
1.2.5.1 形态观察 每日用倒置显微镜观察活细胞生长情况，拍照记录。
1.2.5.2MTT法测定细胞生长曲线 取生长状态良好的上皮细胞，采用上述传代方法消化，制成细胞悬液，计数，以103 ml-1接种于96孔板，每板设复孔且每孔的细胞数保持一致，加入等量培养液（200 μl·孔-1）置培养箱中培养；每天取出1块板，每孔加入MTT溶液（5 mg·ml-1）20 μl，培养箱中继续培养4 h后终止培养，小心吸弃培养上清液，每孔加入150 μl二甲亚砜，室温振荡10 min；在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值（OD570 nm），记录结果，绘制生长曲线。
1.2.5.3 细胞分裂指数测定
用上述传代方法消化，将细胞悬液接种于放有小盖玻片的6孔板中，每12 h取出1个盖玻片，95％酒精固定，HE染色、封片；选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞，计数，绘制细胞分裂指数曲线图。
1.2.5.4 细胞贴壁率测定 取对数生长期细胞，消化法制成细胞悬液，计数，接种于培养皿中，每2 h取出一皿，消化已贴壁细胞，计数，计算贴壁率，绘制贴壁率曲线图。
1.2.6 统计学方法
上述各实验重复4次，应用SPSS14.0 for Windows软件的独立样本T检验对OD570 nm、分裂指数、贴壁率进行统计学分析。
2 结 果
2.1 培养细胞的形态学结果
2.1.1 原代细胞的形态观察
2.1.1.1 消化法 接种后6 h可见细胞贴壁生长，呈圆形或多角形，核呈圆形，位于细胞中央或旁中央区，胞质丰富，可见少数细胞体积较大的老化细胞，同时可见部分悬浮生长的细胞（图1）；培养3 d后细胞呈膜状生长，且伸出板层伪足；培养1周后细胞分裂增殖旺盛，全部呈膜状生长，伸出板层伪足，且细胞已达基本融合状态，并可呈复层生长。
图1 消化法培养6 h 倒置显微镜×100
2.1.1.2 组织块贴壁法 接种后24 h可见从组织块中伸出细胞伪足（图2）；48 h可见从组织块边缘有细胞游出呈晕状生长，形成典型的“沙滩样”移行带（图3）；72 h后大部分组织块上的细胞从移行带向外长出生长晕，细胞核呈圆形，位于细胞中央或旁中央区，胞质丰富，细胞相互紧密连接呈膜状生长，生长界限明显；5 d后迅速旺盛生长，接近组织块的区域可呈复层生长，同时可见悬浮生长的细胞，换液后仍然存在；培养1周后相邻组织块之间细胞晕相接，铺满瓶底，形成良好的单层。
图2 组织块贴壁法培养24 h 倒置显微镜×100
箭头所示为组织块边缘伸出细胞伪足图3 组织块贴壁法培养48 h 倒置显微镜×100
细胞生长界限明显，箭头所示为“沙滩样移行带”
2.1.2 传代细胞的形态观察
组织块培养法：第1、2代细胞接种后1～2 d贴壁生长，形态与原代相似，细胞呈多角形镶嵌排列，1周形成良好的单层铺满瓶底（图4）。第3、4代细胞胞体逐渐变大，形状不规则，10 d可形成单层。第5、6代逐渐出现较大的形状不规则的衰老细胞，胞质内可见空泡、颗粒样物质，细胞间隙增大，并可见细胞凋亡，此时很难形成融合的单层细胞。
图4 第1代培养5 d 倒置显微镜×100
消化法：第1代与原代相似，第3代细胞形态开始变化，第5代细胞衰老很难形成单层。
2.2 MTT法测定细胞生长曲线
如图5所示，体外培养的兔角膜上皮细胞（第2代）生长曲线呈近似“S”形，细胞经过约2 d的滞留期，从3 d后进入迅速增殖的对数生长期，5～7 d后进入平台期生长稳定；在第2、3、5、6、8、9、10天，组织块贴壁法和消化法培养的细胞OD570 nm值的差异有统计学意义，即在上述时间组织块贴壁法培养的有活力细胞数目多于消化法。
*P<0.05
图5 角膜上皮细胞生长曲线2.3 细胞分裂指数
由图6可见，在体外培养的兔角膜上皮细胞（第2代）分裂指数曲线中，细胞经过2 d左右的滞留期迅速进入分裂旺盛的对数生长期，从第5天起细胞分裂几乎停止，生长抑制，进入生长的平台期；从第1.5天至第4天两种培养方法培养的细胞分裂指数的差异具有统计学意义，即在上述时间段组织块培养法培养的细胞分裂指数高于消化法。
*P<0.05
图6 角膜上皮细胞分裂指数
2.4 细胞贴壁率测定
在体外培养的兔角膜上皮细胞（第2代）贴壁率测定中，细胞6 h开始贴壁，到16～18 h接近最高贴壁率值，以后贴壁率变化不大；从第14小时至26小时两种方法培养的细胞的贴壁率差异具有统计学意义，即在上述时间段组织块培养法培养的细胞贴壁率高于消化法，详见图7。
*P<0.05
图7 角膜上皮细胞贴壁率
3 讨 论
自20世纪50年代细胞培养技术兴起以来，角膜细胞的培养技术在国内外已有不少报道，且培养技术一直不断改进［1-3］。但以往的培养技术存在着培养方法复杂（如单层培养法［4］）和培养条件昂贵（如需要在培养液中加入特殊生长因子［5］）等问题。因此，寻求一种取材简单、经济实用的培养方法，对眼表疾病、角膜病的基础研究具有重要意义。基于以往的培养技术，我们在研究中探索、比较并优化了体外原代培养兔角膜上皮细胞的方法。
消化法是培养角膜上皮细胞的一种常见方法，操作过程简便、培养周期短，但消化液的浓度及消化时间不易掌握，且细胞活力会受到影响。本实验中发现，采用单纯胰酶消化法胰蛋白酶浓度过高，细胞活性下降，贴壁率大大降低，过低则不能获得较多的细胞。在反复尝试不同胰蛋白酶浓度及消化时间后，我们采用浓度为0.25％胰蛋白酶两次消化法，可以获得较多数量的细胞，但由于胰蛋白酶对细胞损伤较大，影响细胞活力，原代培养细胞的贴壁率较低，且会出现少量老化细胞。因此，我们选择了胰蛋白酶联合EDTA消化法，并摸索出最佳作用浓度和时间，认为采用0.1％胰蛋白酶-0.02％EDTA两次消化法，可获取较多活力好的上皮细胞，虽然所获得的细胞数量较单纯胰酶消化法少，但细胞贴壁率较高，形态、增殖能力都较单纯胰酶消化法好，很易形成良好的单层细胞。
组织块贴壁法是一种较为传统的培养方法，存在着方法复杂、细胞生长缓慢、周期长、细胞成分不单一等问题。我们在研究中对以往的组织块贴壁法进行了改进：将修剪好的角膜浸于培养液中，在体式显微镜下完整地撕下角膜上皮面，再剪成1 mm3的组织块均匀铺于培养瓶底壁或24孔板中。在整个过程中应注意：（1）取眼球动作迅速，勿伤及角膜。（2）在抗生素中浸泡时间不超过15 min，然后再用PBS反复冲洗2～3次，以避免抗生素对细胞的毒性作用而损伤细胞活力。（3）始终将角膜片浸于培养液中，以保持细胞活性。（4）修剪角膜组织时动作要快，以维护离体组织中的细胞状态。实验中我们发现，组织块培养法的细胞在形态、增殖能力等方面均优于消化法，且原代培养中没有出现老化细胞；形成单层细胞的时间也不比消化法长。由于我们只保留了角膜上皮层，在培养过程中并未出现细胞混杂的情况，也避免了进行细胞纯化这一复杂的步骤。此外，由于24孔板底面积较小，形成细胞单层的时间较短，可以缩短培养周期。因而，以该法培养兔角膜上皮细胞具有较好的经济实用性。
在细胞传代的培养中，我们发现，从第4代起角膜上皮细胞传代后活力下降，形态改变，到5、6代细胞基本老化，停止增殖，提示我们培养体系仍需改进，例如应用饲养层细胞［6］等，以建立进一步完善的体外兔角膜上皮细胞培养体系。
体外培养的兔角膜上皮细胞生长曲线呈近似“S”形，第2代角膜上皮细胞在传代后的第1天细胞数有所减少，经过约2 d的滞留期，随后进入迅速增殖的对数生长期，5～7 d后进入平台期生长稳定，在15 d左右细胞衰老。相应的，在细胞分裂指数曲线中，经过2 d左右的滞留期，细胞迅速进入分裂旺盛的对数生长期，而进入平台期后分裂几乎停止、生长抑制。因而，细胞分裂指数曲线与生长曲线的趋势类似，只是细胞总数达平台期时细胞数量很大，而细胞的分裂值接近0，分裂指数曲线最低。比较两种培养方法，在生长曲线及分裂指数曲线所示的对数生长期，组织块培养法的细胞具有更好的活力且分裂旺盛。在研究角膜上皮细胞贴壁率中，我们发现，消化法细胞的贴壁率在接种后16至26 h低于组织块培养法；细胞接种后6 h开始贴壁，到16～18 h已有约70％的贴壁率，随后贴壁率几乎不再增加，这也是角膜上皮细胞传代培养的一个问题，可能是由于原代细胞中存在状态不好的细胞，在传代培养时就会逐渐衰老、脱壁和凋亡。因此，我们可以认为，兔角膜上皮细胞符合一般有限细胞系的生长规律。
通过多种途径对兔角膜上皮细胞的体外培养方法的研究，我们认为组织块培养法是一种稳定、简单易行、经济实用的培养角膜上皮细胞的方法。
【参考文献】
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