作者：徐国兴，李琼，陈瑾，郑学栋，郭健，谢茂松 作者单位：(350005)中国福建省福州市，福建医科大学附属第一医院眼科 福建省眼科研究所
【摘要】目的：研究体外传代培养对人类视网膜色素上皮（human retinal pigment epithelialium，HRPE）细胞免疫调控能力的影响。方法：建立HRPE细胞与异体淋巴细胞共培养系统，采用流式细胞术检测原代及传代HRPE细胞（第1、2、3、4、5、6代）Fas表达以及诱导异体淋巴细胞凋亡能力的差异。结果：HRPE与淋巴细胞体外共培养时，HRPE细胞Fas表达随着传代逐渐减弱，Fas表达与传代代数呈负相关（阳性细胞率r＝0.859，P＜0.01；平均荧光强度r＝0.880，P＜0.01)，HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡随着传代逐渐减弱，淋巴细胞凋亡率与传代代数呈负相关（r=0.838 ，P<0.01），共培养时传代HRPE细胞Fas表达迅速下降，至第3代与第4代间Fas表达差异无统计学意义（P>0.05）， 共培养时传代HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡率迅速下降，至第3代与第4代间淋巴细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：体外传代培养的HRPE细胞，传代数越大细胞变异越大，第3代后细胞的免疫调控能力明显下降。
【关键词】 视网膜色素上皮细胞;传代培养;淋巴细胞;凋亡
nfluence of serial subcultivation on the immunoregulation of retinal pigment epithelialium cellsin vitro
GuoXing Xu, Qiong Li, Jin Chen, XueDong Zheng, Jian Guo, MaoSong Xie
Foundation items: Science Research Foundation of Ministry of Health of the Peoples Republic of China (No. WKJ20052013); Key Scientific Research Project of Fujian Province (No. 002Y002); Professor Academic Development Fund of Fujian Medical University (No. 2006js6033)
Fujian Ophthalmic Institute, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China
Correspondence to: GuoXing Xu. Fujian Ophthalmic Institute, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, Fujian Province, China. [email protected]
AbstractAIM: To investigate the influence of serial subcultivation on the immunoregulation of retinal pigment epithelialium cells in vitro.METHODS: Coculturesystems of HRPE cells with lymphocytes were established in vitro. The expression of Fas on different passages of HRPE cells and the induction of apoptosis on lymphocytes were observed by flow cytometry.RESULTS: When cocultured with lymphocytes, the expression of Fas was tapering and the duration of culture in vitro were significantly correlated with the expression of Fas (the rate of positive cell: r=0.859, P<0.01, the mean fluorescence intensity: r=0.880,P<0.01). The rate of apoptosis of lymphocytes was taper going down to posterity, and the duration of culture in vitro were significantly correlated with the rate of apoptosis of lymphocytes（r=0.838, P<0.01). The expression of Fas and the rate of apoptosis of lymphocytes quickly descend going down to posterity. There was no difference between the third passage and the fourth passage (P>0.05).
CONCLUSION: HRPE cells beyond 3 passages show a low capability of immunoregulation, and are not suitable for seeds cells for HRPE transplantation.
KEYWORDS: human retinal pigment epithelium; serial subcultivation; transdifferentiation; apoptosis
0引言
随着RPE细胞在视网膜病变修复中的作用不断被认识，RPE细胞移植成为眼科研究的热点[1]。视网膜下腔是位于视网膜神经感觉层和视网膜色素上皮层之间的潜在腔隙，它被认为是眼的免疫赦免地带之一。人们正是利用视网膜下腔的免疫赦免进行RPE细胞移植治疗视网膜色素变性[2]和年龄相关性黄斑变性[3]。RPE细胞的主动免疫调控对于视网膜下腔的免疫赦免起着重要作用。然而RPE是一高分化的单层细胞，其分化特性的维持依赖于合适的外界环境。当外界环境改变时如体外培养状态下RPE细胞会发生一系列变化，称为RPE细胞的转分化现象[4]。本实验在体外培养条件下，建立不同代数HRPE细胞和淋巴细胞的共培养系统，观察不同代数HRPE细胞Fas的表达以及诱导淋巴细胞凋亡的能力，以探讨不同代数HRPE细胞免疫调节作用的差异，为选择HRPE细胞移植的种子细胞奠定前期基础。
1材料和方法
1.1材料
DMEM/F12培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清、小牛血清、2.5g/L胰蛋白酶 0.2g/L EDTA（美国Gibco公司）；PBS粉、人淋巴细胞提取液（美国Sigma公司）；鼠抗人FasPE检测抗体(IgM克隆号7c11 )、AnnexinV/PI凋亡检测试剂（美国beckmancoulter公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养及传代
取角膜移植供体的健康成人眼球，按报告的方法进行取材、原代及传代培养。
1.2.2淋巴细胞悬液的制备
外周血标本中加入生理盐水（1∶1）稀释后沿管壁缓缓加入到含淋巴细胞分离液（2 ∶1）的离心管内，室温2000r/min离心25min，用毛细吸管吸出界面灰黄单个核细胞层，加入适量生理盐水吹打混匀后离心 1200r/min 8min，洗涤细胞 2次。弃上清液，用含100mL/L胎牛血清的 RPMI 1640培养基悬浮细胞。
1.2.3不同代数HRPE细胞与淋巴细胞共培养
原代HRPE细胞培养8d后（约达80%融合时），按1：3传代接种后，取原代和第1、2、3、4、5、6代HRPE细胞各3瓶分别加入同种异体淋巴细胞，实验分淋巴细胞空白对照组、各代RPE细胞共培养组：原代HRPE细胞（P0）；第1代HRPE细胞组（P1）、第2代HRPE细胞组（P2）、第3代HRPE细胞组（P3）、第4代HRPE细胞组（P4）、第5代HRPE细胞组（P5）、第6代HRPE细胞组（P6），每瓶加入1mL淋巴细胞提取液悬液，继续培养72h。
1.2.4检测不同代数HRPE细胞Fas的表达
分别收集培养72h后的HRPE细胞，置入10mL离心管中，短时低速离心1000r/min离心9min，弃上清液，加100mL/L鼠血清PBS液（封闭非特异性结合位点）1mL吹打5min后静置30min，并短时低速离心，弃上清液，加PBS液将细胞吹打均匀，调整细胞浓度2×106/mL，用300目尼龙网过滤成单细胞，加入PE标记的鼠抗人FASIgM抗体20μL，25℃孵育染色 45min,短时低速离心，弃上清液,加入0.4mL PBS上机测定。测量其阳性细胞率和平均荧光强度，结果以±s表示。
1.2.5检测不同传代数HRPE细胞诱导淋巴细胞凋亡的差异
分别收集培养72h后的淋巴细胞，置入10mL的离心管，1000r/min离心5min，弃去上清液,冰PBS清洗一次。用孵育缓冲液洗涤1次，1000~1500r/min离心5min。用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光并不时振动，孵育10~15min。冲洗缓冲液洗涤2次后加入0.4mL PBS重悬，上机检测。测量淋巴细胞凋亡率和平均荧光强度，结果以±s表示。
统计学处理：各组数据均采用±s表示，数据采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理，Fas表达、淋巴细胞凋亡率采用Pearson相关分析。不同代HRPE细胞间Fas表达、淋巴细胞凋亡率的差异采用ANOVA分析。以P<0.05作为差别有统计学意义的检验标准，P<0.01作为差别有极显著统计学意义的检验标准，对P<0.05 者采用LSDt检验进行组间两两比较。
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