正常人及视网膜母细胞瘤患者Rb基因启动子结构、功能和突变的研究
中华肿瘤杂志 1998年第3期第0卷 基础研究
作者：黄倩 汪健 陶勇浩 David W Yandell
单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院(黄倩、陶勇浩)；美国哈佛大学儿童医院心血管系(汪健)；美国佛蒙特州州立大学肿瘤中心(David W Yandell)
关键词： 基因，视网膜母细胞瘤 视网膜母细胞瘤 启动区(遗传学) 转录，遗传 序列分析，DNA 点突变
【摘要】 目的 检测正常人及视网膜母细胞瘤（RB）患者Rb基因5′端调控区的DNA序列，以及不同的DNA片段的转录调控活性，研究Rb基因启动子的结构、功能以及突变对功能的影响和与RB发病的关系。方法 应用SSCP分析及DNA序列测定检测正常人及RB患者Rb基因启动子的DNA序列和点突变；分离Rb基因5′端不同位置及不同大小的DNA片段，通过氯霉素乙酰基转移酶做报告基因，检测不同的DNA片段的转录调控活性。结果 Rb基因产物起始密码上游-327 bp至-87 bp间240 bp的DNA片段具有基本的启动子功能，其上游和下游的DNA序列内可能还存在正或负转录调控元件。100例正常人Rb基因启动子DNA序列未见有任何变异，但302例RB患者中5例有点突变并伴有CAT活性明显降低。结论 Rb基因启动子的DNA序列非常稳定，其突变常常导致启动子活性下降，并与视网膜母细胞瘤的遗传易感性有关。
The structure, function and mutation of Rb gene promoter in normal individuals and retinoblastoma patients Huang Qian*, Wang Jiang, Tao Yonghao*, et al.*The First Clinical Medical School, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To investigate the DNA sequence of the 5′untranslated region of the Rb gene in normal individuals and retinoblastoma patients and identify the elements involved in transcription regulation of Rb gene.Methods SSCP analysis and direct genomic DNA sequencing were used to identify variations or alterations in DNA of normal adult WBC and tumor DNA of retinoblastoma patients. The different DNA fragments located in the 5＇untranslated region of Rb gene were amplified and inserted into an expression plasmid with a CAT reporter gene. The capacity of transcription regulation of isolated DNA fragments was determined by CAT assay.Results A 240 bp DNA fragment located between -327～-87 bp upstream of the first starting codon was shown to be the sequence with essential promoter function. The Sp1/RBF-1, ATF and E2F binding sites were present in this region and positive and negative elements were found further upstream and downstream. Four of 5 naturally occurring mutations were identified in either Sp1/RBF-1 or ATF binding sites from 302 patients with retinoblastoma. All these mutants had reduced CAT activity. However, 100 cases of normal adults did not show any variant DNA sequence in the same region.Conclusion The promoter DNA sequence of Rb gene is quite stable. Its variation usually leads to reduction in promoter activity which may be associated with genetic susceptibility to retinoblastoma.
【Subject words】 Genes, retinoblastoma Retinoblastoma Promoter regions(Genetics) Transcription, genetic Sequence analysis, DNA Point mutation
人类的Rb基因定位在13号染色体长臂一区4带，整个基因长约200 kb，由5′端的调控顺序和27个外显子及位于其间的内含子共同组成［1～3］。Rb基因的功能主要在于阻止G1期细胞向S期转变，调控细胞周期［4］。我们在研究Rb基因编码区结构、功能的基础上［5］，又深入研究了Rb基因启动子的结构、功能以及其突变对转录调控的影响。
材料与方法
1.材料：选择已知Rb基因无异常的、来源于人成纤维细胞的130 A细胞株作为SSCP及DNA序列分析的正常对照，并用于分离克隆Rb基因5′端的调控顺序。100例健康成年人外周血白细胞DNA及302例视网膜母细胞瘤(RB)患者的肿瘤或白细胞DNA按标准方法提取，检测启动子活性的表达质粒载体pCAT basic系美国Promega公司产品，克隆PCR产物的TA cloning kit为美国Invitrogen公司产品，用于检测启动子活性的受体细胞有人宫颈癌细胞株（Hela）、人骨肉瘤细胞株（Saos2）以及鼠成纤维细胞（10T 1/2）。
2.Rb基因5′端不同的DNA片段的分离克隆：根据已发表的Rb基因DNA序列设计并合成引物［2］，分别扩增Rb基因5′端-1 282 bp至-4 bp、-686 bp至-4 bp、-327 bp至-87 bp、-427 bp至+422 bp以及-327 bp至+422 bp 5种不同位置及不同大小的DNA片段。PCR产物首先被插入TA cloning载体，经DNA序列分析证实插入片段无变异后再用限制性内切酶EcoRI消化、琼脂糖凝胶电泳分离纯化并插入pCAT basic多克隆位点的EcoRI位点处，选择正向插入克隆做细胞转染及启动子活性测定。
3.细胞转染及启动子活性分析：选用10 μg的上述重组质粒DNA及5 μg的对照质粒pCMV-β gal DNA，同时转染受体细胞。pCMV-β gal含有巨细胞病毒的启动子(CMV)，并以细菌β-半乳糖苷酶做报告基因。于转染的前一天按5×106将受体细胞接种于10 cm细胞培养皿中，转染方法采用标准的磷酸钙沉淀法。转染后48小时收集被转染细胞，同时测定CAT活性和β-gal活性。以CAT/β-gal活性之比代表所检测的DNA片段的转录调控活性。为了保证实验结果不受偶然因素影响，均同时转染两盘相同的细胞并连续进行两次实验。
4.正常人及RB患者Rb基因启动子DNA序列及其突变的检测：结合SSCP分析及DNA序列测定技术共检测分析了100例正常成年人白细胞DNA及302例RB患者的肿瘤和白细胞DNA，检测范围包括 Rb基因第1外显子及其上游-327 bp的DNA序列。
5.Rb基因点突变对Rb基因转录活性的影响：采用上述DNA片段分离克隆、细胞转染及CAT活性测定方法，以正常的Rb基因启动子做对照，检测分析RB肿瘤DNA Rb基因启动子点突变对转录调控功能的影响。
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