结果

　　1.Rb基因5′端不同的DNA片段的转录调控活性分析：Rb基因5′端不同位置及不同长度的DNA片段其CAT活性明显不同，在不同的受体细胞内CAT活性也有一些差异。附表显示的是不同的DNA片段在Hela细胞内CAT活性检测结果，可见起始密码上游-327 bp至-87 bp间240 bp的DNA片段即有基本的启动子活性，但-686 bp至-4 bp间的DNA片段显示出更强的转录调控活性。此外，由于-427 bp至+422 bp间DNA片段的CAT活性明显高于 -327 bp至+422 bp DNA片段，提示在-686 bp至-327 bp间存在较强的正调控元件。然而，包含这一序列在内及其进一步上游的DNA片段（-1 282 bp至-4 bp）却表现出明显减弱的CAT活性，提示在-1 282 bp至-686 bp间可能存在负调控元件。与此相似，在-327 bp至+422 bp间的DNA片段的CAT活性明显低于-327 bp至-87 bp DNA片段，提示在-87 bp至+422 bp间也可能存在负调控元件。

　　2.Rb基因启动子内最重要的转录调控因子结合位点：Rb基因5′端DNA序列分析表明，Rb基因-327至-87 bp间的DNA片段具有启动子的基本结构，包括富含C和G，有转录调控因子Sp1、ATF及E2F结合位点，但缺乏典型的TAAT和CAAT盒。

　　附表　正常人及RB肿瘤Rb基因启动子CAT活性检测分析

　　注：N为正常对照Rb基因启动子DNA片段；Mu为RB肿瘤Rb基因启动子(-327 bp至-87 bp DNA片段)

　　100例正常人及302例RB患者Rb基因启动子DNA序列分析结果表明，正常人Rb基因启动子的结构和序列未见有任何变异。在RB患者中，有5例存在点突变，其中1例为-210 bp处T→C的替换，位于Sp1结合位点上游6 bp；1例为-205 bp至-197 bp处11 bp缺失，恰巧造成Sp1结合位点丧失；1例-193 bp处 C突变为A；另1例-188 bp处G突变为T，两者均累及ATF结合位点；尚有1例G→T突变，位于-146 bp处，即E2F结合位点下游33 bp。CAT活性检测证实，这5例点突变均导致CAT活性明显降低（附表）。

　　3.Rb基因启动子点突变与RB发病的关系：5例有Rb基因启动子点突变的RB患者中，4例收集到了外周血标本，这4例患者的白细胞DNA中存在与RB肿瘤相同的点突变，提示突变是种系细胞起源的。根据临床检查及随访结果，这4例RB患者中，2例双眼发病，2例单眼发病。其中1例单眼患者有RB家族史，该家系中另1例患者也是单眼发病。

　　讨论

　　尽管曾有文献报道Rb基因产物起始密码下游+13 bp至+83 bp间仅70 bp的DNA序列即有基本的启动子活性［3］，但我们和Sakai等［6］以及Zacksenhaus等［7］的研究结果表明，Rb基因起始密码上游，特别是含有Sp1、ATF及E2F结合位点的DNA片段才是Rb基因最基本的转录调控元件。此外，我们的研究结果还表明，其上游和下游的DNA序列还存在其他的正或负调控元件。

　　Sp1、ATF及E2F 3个结合位点紧密相邻位于-206 bp至-178 bp间。根据文献报道，Rb基因启动子的Sp1结合位点虽可与转录调控因子Sp1结合，但亲和力较低。而与Rb基因启动子Sp1位点紧密结合的却是另一类核蛋白，被称为RBF-1(retinoblastoma binding factor-1)［6］。进一步研究发现，RBF-1可识别特异的DNA序列5′-GGCGGAAGT-3′，这一序列与Sp1和ATF位点重叠。SP1/RBF-1和ATF起促进转录的作用［8］，而E2F则抑制转录［9］。

　　Rb基因启动子的DNA序列相当稳定并高度保守，一方面表现为我们所报道的正常人Rb基因启动子的DNA序列未见变异，另一方面正如Zacksenhaus等［7］所证实的人类与鼠类Rb基因启动子的结构相似，其80%的DNA序列享有同源性。本研究中5例自然发生在Rb基因启动子的点突变主要发生在Sp1/RBF-1和ATF结合位点处，CAT活性检测结果表明，这些突变均伴有明显的转录调控功能降低，表明Sp1/RBF-1和ATF在调控Rb基因表达方面起重要作用。此外，5例有Rb基因启动子点突变的RB患者中，有4例其突变属种系细胞起源，提示该类突变与患者发生RB的遗传易感性有关。

　　参考文献

　　1Friend S, Bernards R, Rogelj S, et al. A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. Nature, 1986, 323:643-646.

　　2McGee T, Yandell D, Dryja T, et al. Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. Gene, 1989,80: 119-128.

　　3Hong FD, Huang HJS, To H, et al. Structure of the human retinoblastoma gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1989, 86:5502-5506.

　　4Goodwish D, Wang NP, Qian YW, et al. The retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. Cell, 1991, 67: 293-302.

　　5黄倩，Thaddeus P, Dryja, 等. RB患者肿瘤及体细胞中RB基因点突变谱及其特征和意义. 中华眼底病杂志，1995，11：240-243.

　　6Sakai T, Ohtani N, McGee TC, et al. Oncogenic germline mutations in Spl and ATF sites in the human retinoblastoma gene. Nature, 1991, 353: 83-87.

　　7Zacksenhaus E, Gill M, Phillips RA, et al. Molecular cloning and characterization of the mouse RB1 promoter. Oncogene, 1993, 8: 2343-2351.

　　8Savoysky E, Mizuno T, Sowa Y, et al. The retinoblastoma binding factor 1 (RBF-1) site in RB gene promoter binds preferentially E4tf1, a member of the Ets transcription factor family. Oncogene, 1994, 9:1839-1846.

　　9Ohtani Fujita N, Fujita T, Takahashi R, et al. A silencer element in the retinoblastoma tumor-suppressor gene. Oncogene, 1994, 9:1703-1711.

　　(收稿：1997-11-03　　修回：1997-12-29)

上一页  [1] [2]