作者：侯玮玮,蒋 犁，乔立兴 作者单位：1.江苏省苏北人民医院 儿科,江苏 扬州；2.东南大学附属中大医院 儿科,江苏 南京
【摘要】 目的 建立酸中毒诱导早产儿视网膜病（ROP）大鼠动物(AIR)模型,观察血管内皮生长因子（VEGF）、色素上皮衍生因子（PEDF）在正常新生大鼠及ROP模型大鼠视网膜中的表达变化规律,探讨二者表达变化与酸中毒的关系、对视网膜血管发育的作用以及在酸中毒诱导ROP进程中的作用。方法 1日龄SD新生大鼠随机分为酸中毒诱导模型组（ROP组）和正常对照组。应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定全视网膜VEGF、PEDF的mRNA水平。结果 RTPCR结果显示,8日龄ROP大鼠VEGF mRNA转录水平明显低于C组（P<0.05）,停止管饲NH4Cl后ROP组VEGF mRNA转录水平逐渐增强,10日龄、13日龄ROP大鼠视网膜VEGF mRNA转录水平明显上升,较对照组明显增强（P<0.05）。5日龄、8日龄ROP大鼠视网膜PEDF mRNA表达水平明显高于对照组（P<0.05）,而在停止管饲NH4Cl的10日龄、13日龄视网膜中其表达水平低于对照组（P<0.05）。在实验过程中PEDF mRNA的表达趋势与VEGF相反；ROP组大鼠在酸中毒期间其VEGF mRNA/PEDF mRNA之值明显降低,停止管饲NH4Cl后,VEGF mRNA/PEDF mRNA之值升高,与对照组相比差异有显著性（P<0.05）。结论 酸中毒使VEGF mRNA表达下调,PEDF mRNA表达上调；停止管饲NH4Cl后二者表达的影响与酸中毒时相反；VEGF、PEDF可能在视网膜正常血管发育及ROP的新生血管化进程中起重要作用,二者比率变化过程与视网膜新生血管发展进程有关。
【关键词】 视网膜病；酸中毒；血管内皮生长因子；色素上皮衍生因子；视网膜新生血管;大鼠
Expression of VEGF and PEDF in a rat model of acidosisinduced retinopathy
HOU Weiwei1,JIANG Li2,QIAO Lixing2(1.Department of Pediatrics,Subei Peoples Hospital of Jiangsu Province,Yangzhou 225001,China;2.Department of Pediatrics,
Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China)
Abstract:Objective To establish an animal model of acidosisinduced retinopathy (AIR),analyze the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and pigment epitheliumderived factor(PEDF) in a rat model of acidosisinduced retinopathy and to elucidate the action of VEGF and PEDF in the process of neovascularization in retinopathy of prematurity(ROP).Methods Newborn SpragueDawley rats were randomly divided into acidosisinduced retinopathy group（ROP group） and control group.Reversal transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR) was used to quantify the changes of VEGF mRNA and PEDF mRNA in each group.Results RTPCR showed that the transcription of VEGF mRNA of ROP group at the 8th was significantly lower than control group,and started to gradually increas after stopping the NH4Cl feeding.Especially on the 10th and 13th day,the transcription of VEGF mRNA of ROP group is much higher than the control group.The changes of PEDF mRNA were opposite to VEGF mRNA.The retina VEGF/PEDF mRNA retio of ROP group decreased significantly than the control group during asidosis,and increased when tubal feeding of NH4Cl was stopped.Conclusions The periods of acidosis result in downregulation of VEGF and upregulation of PEDF.The time course of the VEGF/PEDF ratio change correlats with the progression of retinal neovascularization.These results suggest that an unbalance between angiogenic stimulators and inhibitors may contribute to retinal neovascularization.The abnormal retina VEGF/PEDF retio may play an important role in the development of neovascularization in ROP．
Key words:retinopathy of prematurity；acidosis；vascular endothelial growth factor;pigment epitheliumderived factor;retinal neovascularization;rats
（Modern Medical Journal,2009,37:17）
早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity,ROP)是1942年Terry首先报道的早产儿晶体后纤维增生的一种疾病。目前ROP已成为儿童失明的主要原因之一,占儿童致盲原因的6%～18%［1］。至今ROP的病因及发病机制尚不完全清楚。目前研究认为，早产、低出生体重是ROP的根本原因,氧疗是常见的危险因素。但尽管在严密控制用氧的情况下,ROP仍然是发达国家导致儿童视力损害的首要原因。这说明除了高氧之外还有其他导致ROP的因素。目前研究认为,酸中毒可作为ROP一个独立的危险因素,且已有用不同方法引起酸中毒诱导新生大鼠出现视网膜新生血管［23］的报道。
ROP的发病机制尚未完全清楚。目前研究认为,ROP主要是视网膜血管发育不全和病理性新生血管形成所致。新生血管的形成是极其复杂的生物学过程,是众多血管因子相互作用、相互调节的结果。血管的正常生长发育,依靠体内血管生成刺激因子［以血管内皮生长因子（VEGF）为代表］和血管生成抑制因子［以色素上皮细胞衍生因子（PEDF）为代表］二者共同平衡调节来实现。当它们平衡关系受到破坏,血管就会出现异常生长［4］。 VEGF是血管内皮特异性的生长因子,在血管生长过程中起中心调控作用。PEDF是视网膜色素上皮细胞分泌的一种蛋白质,对视网膜存活及血管生长起重要作用。Bouck等［5］发现，PEDF可有效抑制眼新生血管鼠模型中的新生血管生长。至今,在酸中毒诱导的早产儿视网膜病大鼠动物（AIR）模型下,VEGF和PEDF在致异常新生血管发生过程中的变化规律及其与酸中毒的相关性国内未见相关报道。
本实验以血管的正常生长依靠体内血管生成刺激因子和血管生成抑制因子二者共同平衡调节为突破点,在成功建立AIR模型基础上,对作用于ROP血管异常生长的两个主要细胞因子——VEGF和PEDF进行较全面研究,探讨二者在酸中毒致ROP新生血管化进程中所起的作用,为研究ROP新生血管化的可能机制提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 动物模型制作与分组
用新生SpragueDawley(SD)大鼠128只,雌雄不限,出生体重为6.0～7.0 g,出生24 h内分为8组,每组16只,与1只母鼠共同饲养。任选其中4组从出生第2天开始采用管饲NH4Cl的方法建立酸中毒模型［6］。另外4组作为同龄正常对照组,分别在出生后3、5、8、10、13、20 d处死动物。
1.2 动脉血气测定及视网膜铺片（ADP酶组织化学法）
两组各时间点分别取6只新生鼠(12只眼)进行视网膜铺片,以观察视网膜血管发育及增生情况。具体方法为：麻醉后打开胸腔,暴露心脏,用灌注针头刺入左心室,抽血0.5～1 ml用于血气分析。摘除新生鼠眼球,固定于4%多聚甲醛溶液中。在眼球角膜缘后约1 mm处作环形剪开,以视乳头为中心,作4或5个放射状切口。用浓度为0.05 mol·L-1、pH值为7.2的Tris马来酸缓冲液冲洗5次,每次15 min。于37 ℃反应液中孵育15 min后用10%硫化铵反应5 min。光学显微镜下观察结果。
1.3 病理标本制作
两组各时间点分别选取3只新生鼠（6只眼）行颈椎脱臼处死,摘除眼球并标记方向。具体方法为:摘除的眼球放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h,梯度酒精脱水,二甲苯透明。石蜡切片经常规HE染色,光学显微镜下观察结果。
1.4 视网膜新生血管内皮细胞核计数
每只眼球间断取10个病理切片,相邻2个切片间隔60 μm(10张切片),统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。
1.5 VEGF和PEDF的RTPCR（二步法）
两组分别选取5、8、10、13 d大鼠各6只（48只眼）进行取材。采用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0试剂盒进行RTPCR反应。逆转录反应条件为:42 ℃ 30 min、99 ℃ 5 min、5 ℃ 5 min，1个循环。PCR反应条件为:94 ℃ 2 min,1个循环;94 ℃ 30 s、54 ℃ 60 s、72 ℃ 2 min,共32个循环。
1.6 PCR产物的检测
取各组的PCR产物5 μl,,在含有0.5 μg·ml-1溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,凝胶成像系统进行灰度扫描,记录VEGF、PEDF及相应βactin的A值,进行半定量分析。
1.7 统计学处理
数据以x-±s表示,统计学处理采用SPSS 13.0软件,进行2组间t检验；各组间行方差分析，比较实验组、对照组不同日龄视网膜VEGF mRNA、PEDF mRNA表达的差异,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各时间点动脉血气情况
见表1。 表1 两组大鼠各时间点动脉血气情况
2.2 视网膜血管形态变化
新生大鼠出生时视网膜血管没有发育完全,随着时间延长,视网膜血管从中央不断向周边生长,出生后第20天,模型组和对照组大鼠的视网膜完全血管化。对照组：幼鼠出生第5天视网膜血管以视乳头为中心,呈放射状均匀分布,管径较粗,周边血管网结构清晰,可见部分无灌注区。第8、10天时无灌注区逐渐减少；第13天时成熟的毛细血管网几乎覆盖整个视网膜,自视盘发出的大血管呈放射状均匀分布至视网膜周边,血管网深浅层结构清晰,表层血管呈均匀放射状,深层血管呈多角型网状结构,第20天时视网膜完全血管化。模型组：出生第5、8天视网膜血管发育滞缓,管径变细,分支减少,中央部及中周部出现大片无灌注区。第10天（即停止管饲NH4Cl后2 d）,视网膜无灌注区明显减小,视网膜中周部有较多的新生血管形成,但血管结构紊乱,呈片、簇、丛状,丧失了正常的放射状及多边形网状结构,视网膜仍有少量无灌注区。见图1。
A.模型组第10天,视网膜仍有
少量无灌注区,血管发育不良
B.对照组第10天,大血管呈均匀放射状分布
图1 两组大鼠视网膜血管形态变化 ADP×100
2.3 两组大鼠视网膜血管增生比较
模型组10 d龄大鼠HE染色切片显示有较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核,平均每张切片为（13.88±2.23）个。而对照组HE切片未见或极少见突破内界膜的血管内皮细胞核,仅（0.88±0.84）个,两者比较有显著性差异（t=283.09,P＜0.000 1）。见图2。
A.对照组10 d时未见异常新生血管
B.模型组10 d时可见突破基底膜异常新生血管
图2 两组大鼠视网膜血管异常增生情况 HE×400
2.4 不同日龄新生大鼠视网膜VEGF mRNA表达的变化 5日龄模型组视网膜：VEGF/βactin mRNA吸光度比值（A值）与对照组相比差异无显著性（P＞0.05），与同组8、10、13日龄大鼠比较差异有显著性（P<0.05）。
8日龄模型组视网膜：即酸中毒第8天,VEGF/βactin mRNA A值比对照组明显下降,两者差异有显著性（P<0.05），与同组5、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。
10日龄模型组视网膜：即停管饲NH4Cl后2 d,VEGF/βactin mRNA A值明显上调,与对照组比较,差异有显著性（P<0.05），与同组5、8、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。
13日龄模型组视网膜：即停管饲NH4Cl后5 d,VEGF/βactin mRNA A值仍较对照组高,两者比较差异有显著性（P<0.05），但较10日龄时有所降低,与同组5、8日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。见表2、图2。表 2 两组不同时间视网膜VEGF mRNA的表达情况
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