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2.5 不同日龄新生大鼠视网膜PEDF mRNA表达的变化 5日龄模型组视网膜：PEDF/βactin mRNA A值高于对照组,差异有显著性（P<0.05），与同组8、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。
8日龄模型组视网膜：即酸中毒第8天,PEDF/βactin mRNA A值明显升高,与对照组比较差异有显著性（P<0.05），与同组5、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。
10日龄模型组视网膜：即停管饲NH4Cl后2 d,实验组PEDF/βactin mRNA A值呈现下降趋势,比对照组明显下调,差异有显著性（P<0.05），与同组5、8、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（P<0.05）。
13日龄模型组视网膜：实验组PEDF/βactin mRNA A值较10日龄时有所升高（P<0.05）,基本接近正常水平,与对照组比较差异无显著性（P＞0.05），与同组5、8日龄大鼠比较差异有显著性（P<0.05）。见表3、图3。表3 两组PEDF mRNA在视网膜的表达情况
2.6 不同日龄新生大鼠视网膜VEGF与PEDF mRNA A值比 见表4。5日龄模型组大鼠视网膜：实验组VEGF与PEDF mRNA A值比低于对照组,差异有显著性（P<0.05），与同组8、10、13日龄大鼠比较差异亦有显著性（均P<0.05）。
8日龄模型组视网膜：VEGF与PEDF mRNA A值比与对照组相比明显降低,约是对照组的1/12,差异有显著性（P<0.05），与同组10、13日龄大鼠比较差异亦均有显著性（均P<0.05）。
10日龄模型组视网膜：停管饲NH4Cl后2 d,实验组VEGF与PEDF mRNA A值比迅速升高,明显高于对照组,约是对照组比值的3.5倍,差异有显著性（P<0.05），亦明显高于同组5、10、13日龄大鼠（均P<0.05）。
13日龄模型组视网膜：VEGF与PEDF mRNA A值比较同组10日龄大鼠有所回落（P<0.05）,但仍高于对照组,两组比较差异有显著性（P<0.05），亦明显高于同组5、8日龄大鼠（均P<0.05）。 表4 两组大鼠视网膜VEGF/PEDF mRNA表达的A值比与同日龄对照组比较，* P<0.05；与8日龄模型组比较，△P<0.05；与8日龄对照组比较，#P<0.05
3 讨 论
本实验选用SD新生大鼠作为诱导视网膜新生血管的模型动物,是因产后3 d内的新生鼠视网膜发育与人孕36周胎儿相似［7］,可作为研究早产儿视网膜发育特点的动物模型。同时它具有生长快、繁育性能好、存活率高等优点。
早产、低出生体重儿肾小管不成熟，分泌H+的功能差,排出HCO-3的阈值低,容易发生代谢性酸中毒。研究显示，酸中毒可作为ROP一个独立的危险因素［3］。正常大鼠血气pH值为7.46±0.01［8］。本实验模型组在管饲NH4Cl期间行动脉血气分析，结果示pH值明显低于正常参考值,处于酸中毒状态,证明建模成功。Chen等［9］的酸中毒模型结果显示，酸中毒可引起新生鼠视网膜新生血管形成,酸中毒的持续时间越长,新生血管形成的发生率越高(酸中毒1、3、6 d,新生血管形成的发生率分别为34%、38%和55%),并且在酸中毒后的2～5 d发生率最高。在本实验中，模型组新生大鼠在酸中毒后第2天视网膜血管出现明显的病理性生长,突破内界膜的新生血管内皮细胞核数明显超过对照组,提示模型组大鼠从酸中毒状态下回到正常血气状态时,引起了视网膜新生血管的明显生长,这与Chen等［9］的研究结果相符。ADP酶组织染色结果显示，实验组视网膜血管出现了两个阶段的变化：新生大鼠在酸中毒环境中7 d后,视网膜血管化进程推迟,视网膜血管收缩、闭塞,发育不良,出现大片的无灌注区；停止管饲NH4Cl 2 d后,血管出现代偿性的扩张、迂曲,并形成了大量新生血管,以缓解视网膜的缺氧缺血状态,但新生血管出现了形态结构异常,呈现病理性生长,其视网膜血管的改变符合ROP的病理过程。本实验模型组大鼠的视网膜新生血管发生在视网膜血管区与无血管区的交界处,类似于人类ROP中新生血管的发生部位［10］。目前,酸中毒致视网膜异常新生血管的机制尚不完全清楚,其可能的机制是:酸中毒引起VEGF mRNA下调,pH值波动使VEGF短暂上调,导致新生血管形成。
ROP的特征是视网膜的异常新生血管化,新生血管的形成在其发生发展中起主导作用。血管生成是一个复杂的过程,多种细胞因子参与新生血管生成的调控。
VEGF是目前已知的功能最强的血管生成促进因子,它是血管内皮特异性的生长因子,在血管生长过程中起中心调控作用。OhnoMatsui等［11］在用视紫红质启动子启动的VEGF转基因鼠研究中发现,VEGF高水平的表达会引起成年大鼠明显的视网膜新生血管形成和牵拉性视网膜脱离。在本实验过程中,我们看到酸中毒诱导ROP模型组新生大鼠视网膜VEGF mRNA的表达水平与对照组相比有显著改变。酸中毒期间,ROP模型大鼠视网膜VEGF mRNA表达显著下降,处于低水平表达状态,酸中毒使VEGF的基因表达受到抑制,这个时期ROP模型组大鼠视网膜血管普遍出现收缩、闭塞,可以看出酸中毒对VEGF表达的抑制影响了ROP模型组大鼠视网膜血管的正常发育进程,使之发育滞缓。当脱离酸中毒环境后，VEGF mRNA表达水平迅速上调,超过了正常同龄大鼠的VEGF水平,视网膜血管也随之表现为过度活跃增生。可见VEGF在ROP模型大鼠视网膜上的表达强度与视网膜新生血管的发生呈明确的时空对应关系。据此我们可以推断,VEGF表达的变化在酸中毒导致的血管关闭和消失以及增生过程中起着重要媒介作用,与血管发育的活跃程度以及血管增生强度有密切关系。
正常组织血管的稳态生长发育是新生血管促进因素和抑制因素这两者相互制约平衡、共同作用的结果,以VEGF为代表的血管生长促进因素并不是惟一起作用的因素［12］。
PEDF是一种主要存在于眼组织的内源性新生血管抑制因子。1989年,Tombran等［13］首次将其从色素上皮中提纯并克隆。Matsuoka等［14］研究发现,PEDF还具有强大的血管生长抑制功能。本实验从PEDF mRNA水平检测PEDF在酸中毒诱导ROP大鼠模型视网膜中的动态表达变化,探讨PEDF与视网膜新生血管生成的相关性。实验结果显示,5日和8日龄ROP模型组大鼠处于酸中毒状态时,视网膜PEDF mRNA的表达是上调的,此时期视网膜血管收缩、闭塞,处于生长滞缓阶段。而停止管饲NH4Cl后,即10日、13日龄ROP模型组大鼠视网膜PEDF mRNA的表达呈现明显的下调,而此时期视网膜血管的生长则表现得非常活跃,出现大量的新生血管。在正常新生大鼠视网膜中,PEDF的变化趋势同样与视网膜血管的生长有密切关联。通过两组大鼠的实验对比不难发现,PEDF的变化趋势与同期视网膜血管生长状态处于同步,8日龄ROP模型组大鼠PEDF表达处于最高水平,而此时视网膜血管生长处于最低水平；当10日龄PEDF表达处于最低谷时,ROP模型组大鼠视网膜血管的生长处于最活跃期,这表明PEDF与视网膜新生血管的形成有非常密切的关系。我们据此推测，酸中毒诱导的视网膜新生血管的产生不仅是由于VEGF的增多,而且也和PEDF的下降密切相关。作为目前抗血管生成作用最强的细胞因子,PEDF表达水平的下调可能是参与视网膜新生血管生成的重要因素之一。
从本实验结果可见,ROP模型大鼠在酸中毒期间,VEGF表达下调,PEDF表达上调,停止管饲NH4Cl后VEGF表达上调,PEDF表达相应下调,这导致了VEGF/PEDF值在酸中毒期间明显低于对照组,在酸中毒后高于对照组。据此我们可以推断，VEGF/PEDF的表达平衡失调在酸中毒诱导ROP新生血管生成过程中起重要作用。
总之,本研究明确了在代谢性酸中毒引起的视网膜新生血管动物模型中,视网膜血管化的程度和新生血管随时间的发展而变化,在酸中毒期,VEGF表达下调,而PEDF表达上调,视网膜血管发育受到抑制；在停止酸中毒后VEGF表达上调,PEDF下调,此时视网膜异常新生血管形成明显。通过本实验可以看出，VEGF、PEDF之间的异常变化在视网膜异常新生血管形成过程中发挥重要作用。这为今后早产儿ROP发病机制的研究奠定了一定的实验基础。但由于新生血管的形成是极其复杂的生物学过程,是众多血管因子相互作用、相互调节的结果，本实验仅进行了VEGF、PEDF与血管内皮细胞核的关系,本课题组在进一步的研究中将关注其他细胞因子在ROP异常新生血管形成中的作用,以期进一步了解ROP的发病机制,为有效的内科干预手段提供实验依据。
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