作者：陈三杰，朱益华 作者单位：中国福建省科技厅重点资助项目(No.C0520003) (350004)中国福建省福州市，福建医科大学附属第一医院眼科
【摘要】 目的：探讨急性高眼压大鼠视网膜RhoA的分布及表达变化。方法：将56只SD大鼠随机分成正常对照组、急性高眼压后1，3，7d共4组，用免疫组化和半定量RTPCR方法检测大鼠视网膜组织中的RhoA的分布及表达情况。结果：正常及急性高眼压后1d，RhoA主要分布于视网膜神经纤维层及神经节细胞层;3d分布于神经节细胞层及内丛状层;7d分布于神经节细胞层、内丛状层、内核层及外丛状层。半定量RTPCR提示：在正常大鼠视网膜组织中，RhoA mRNA仅有微量表达，急性高眼压后1，3，7d，RhoA表达均显著高于正常组(P<0.05)，7d组表达量最高。结论：大鼠急性高眼压损伤后，视网膜RhoA蛋白的分布及表达显著增加，其在介导抑制性信号阻断轴突再生的抑制过程中发挥着重要作用。
【关键词】 急性高眼压;视网膜;RhoA
Distribution and expression of RhoA in rat retina after acute high intraocular pressure
SanJie Chen, YiHua Zhu
Foundation item: Key Projects of Fujian Provincial Science and Technology Department, China(No.C0520003)
Department of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350004, Fujian Province, China
Abstract
AIM: To investigate the distribution and expression of RhoA in the rat retina after acute high intraocular pressure.
METHODS: Totally 56 SD rats were equally divided into 4 groups: normal group, 1 day, 3 days, 7 days group after establishing acute high intraocular pressure models. The distribution of RhoA in the retina was assayed by immunohistochemistry and the expression was analyzed by semiquantitative RTPCR.
RESULTS: In normal retina and 1 day after acute high intraocular pressure (AHIOP)，RhoA was mainly distributed in retinal ganglion cell layer(GCL).In the group of 3 days after AHIOP，it existed in GCL and inner plexiform layer(IPL). However, it was detected not only in GCL and IPL but also in the inner nuclear layer(INL) and outer plexiform layer(OPL)in the group of 7 days after AHIOP. RTPCR showed that expression of RhoA mRNA was minimal. However, the expression of RhoA in three groups of AHIOP was increased significantly than normal group (P<0.05).
CONCLUSION: The distribution and expression of RhoA are extended and enhanced after AHIOP, RhoA play an important rule in the course of inhibiting axon regrowth.
KEYWORDS: acute high intraocular pressure; retina;
0引言
RhoA是一类小GTP酶，分子量为20～30kDa，属于Ras超家系中的一类，Rho GTPases以结合GDP(无活性)和结合GTP(有活性)的方式发挥主要的分子开关作用，其通过激活下游的Rho激酶(Rho kinase，ROCK)，能够使肌球蛋白磷酸酶磷酸化而失活，使得肌球蛋白磷酸化程度增高，影响肌动球蛋白系统从而导致神经轴突生长锥的塌陷、抑制轴突生长[13]。RhoA是抑制中枢神经轴突再生的重要信号传导物质，为此我们通过建立大鼠急性高眼压模型，用免疫组化及RTPCR方法研究RhoA在急性高眼压大鼠视网膜的分布及表达，为进一步研究视神经及视网膜损伤和修复过程中RhoA所起的作用奠定基础。
1材料和方法
1.1材料 成年SD大鼠56只，体质量200～250g，雌雄不限，双眼检查正常。由福建医科大学实验动物中心提供，完全随机分为4组：正常对照组及急性高眼压后1，3，7d组，每组14只。
1.2方法 大鼠急性高眼压模型的建立：以100g/L水合氯醛3.5mL/kg行腹腔注射，深度麻醉大鼠，将连接生理盐水瓶输液管的7号头皮针沿颞侧角巩缘刺入眼前房，然后升高输液瓶至输液的高度与动物眼垂直距离为150cm处，可造成大鼠眼内110mmHg的人为高眼压，观察并检测输液瓶内的液体有无向眼内灌注[4]。此时可见球结膜苍白，视网膜苍白水肿，说明视网膜的中央动脉供血已被完
图1 急性高眼压后RhoA在视网膜的分布情况(DAB×400) A:正常对照组;B: AHIOP后1d组;C: AHIOP后3d组;D: AHIOP后7d组
全阻断，抗生素滴眼以保持角膜湿润并预防感染，高眼压状态持续30min后，拔出输液针头，可见球结膜颜色迅速恢复正常，眼底检查见视网膜呈橘红色，说明阻断的血管重新开放，已形成再灌注。免疫组织化学染色：每组6只，共24只大鼠，以100g/L水合氯醛3.5mL/kg腹腔注射，全身麻醉成功后40g/L多聚甲醛心脏灌注，摘除眼球，100g/L甲醛固定，制成石蜡切片，采用二步法非生物素免疫组化染色;一抗为抗大鼠RhoA单克隆抗体(1∶200，PBS稀释，购自santa cruz公司)，非生物素免疫组试剂盒(购自北京中杉金桥，PV6002)，阴性对照组以PBS 代替一抗，DAB显色，苏木素复染。半定量RTPCR：每组8只,共32只大鼠，处死后取大鼠视网膜组织，放置80℃冰箱内保存备用。用Trizol试剂盒(购自大连宝生物工程公司)提取总RNA，用全自动紫外分光光度计测光密度值检测有无污染, 15g/L琼脂糖电泳检测完整性。80℃保存。依照试剂盒说明, 用RNA 6μL逆转录成cDNA, 总体积20μL,采用冷启动法进行PCR 反应。PCR 反应参数: 94℃预变性2min, 94℃ 40s, 58.5℃ 40s, 72℃ 60s,共35个循环;72℃进一步延伸5min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对电泳条带进行灰度分析,以βactin的光密度作为内参照,计算RhoA与βactin的相对值。RhoA及βactin引物用Primer 5.0软件设计,序列如下: βactin上游引物序列5′GGGAAATCGTGCGTGACAT3′, 下游引物序列5′TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′,产物片段长度385bp; RhoA上游引物序列5′CAGGTAGAGTTGGCTTTATGG3′, 下游引物序列5′CTCCGTCTTTGGTCTTTGCT3′,产物片段长度276bp。
统计学分析：数据以±s表示，应用SPSS 11.0统计软件行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1大鼠急性高眼压后RhoA在视网膜中的分布变化 正常大鼠视网膜中，神经节细胞层仅见少量RhoA表达，其余各层均未见RhoA阳性染色(图1A);急性高眼压后1d，RhoA主要分布于神经节细胞层(图1B);急性高眼压后3d，RhoA主要分布于神经节细胞层及内丛层(图1C);急性高眼压后7d，于神经节细胞层、内丛状层，内核层及外丛状层均可见RhoA阳性表达(图1D)。大鼠急性高眼压后，RhoA在视网膜的表达增高，分布范围随急性高眼压损伤的时间的延长而扩大。
图2 大鼠视网膜RhoA及βactin mRNA的表达 M：marker;N：正常对照组;1d：AHIOP后1d组;3d：AHIOP后3d组;7d：AHIOP后7d组
2.2大鼠急性高眼压后RhoA mRNA在视网膜中的表达变化 组织总RNA经逆转录、扩增得到目的基因的片段与预计结果相同(图2)。在正常视网膜组织中，RhoA mRNA表达甚微，目的基因与内对照的吸光度比值为0.217±0.024，AHIOP后其表达增加，1，3，7d分别为0.427±0.046，0.753±0.094和1.122±0.253，与正常对照组相比，均有显著性差异(P<0.05)。
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