作者：王红 陶远 作者单位：山东大学齐鲁医院眼科， 山东 济南 250012
【摘要】 目的：探讨B细胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcell lymphoma/leukemia 2，Bcl2）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）在透镜诱导豚鼠近视眼后极部巩膜细胞中的表达，以及二者对巩膜细胞凋亡的影响。方法：选健康4周龄豚鼠45只，随机分成3组，Ⅰ组（右眼配戴20D）、Ⅱ组（右眼配戴10D） Ⅲ组（不作任何干预）。实验前后用睫状肌麻痹下验光、A超动态观察豚鼠眼屈光度和眼轴长度，并取后极部巩膜组织，用电镜、终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导原位缺口末端标记法（TUNEL）和流式细胞术检测巩膜的凋亡细胞, 应用免疫组织化学染色和蛋白印迹（Westernblot）法检测bFGF和bcl2蛋白。结果:实验后诱导眼形成近视，且伴有眼轴延长。并在诱导眼巩膜细胞中检测到凋亡细胞，凋亡率高于对照组（P＜0.05)，透镜诱导的豚鼠近视眼后极部巩膜组织中bFGF和bcl2的含量降低（P＜0.05)。结论: bFGF与bcl2在透镜诱导豚鼠近视眼后极部巩膜细胞中表达阳性，并可通过抑制细胞凋亡参与透镜诱导豚鼠近视的形成。
【关键词】 近视 细胞凋亡 碱性成纤维细胞生长因子 B细胞淋巴瘤/白血病2基因 巩膜
［ABSTRACT］ Objective： To explore the expression of Bcell lymphoma/leukemia 2 and basic fibroblast growth factor in lensinduced myopia sclera of guinea pigs and evaluate the effect of the two factors on apoptosis of the sclera cells. Methods: A -20D concave or -10D concave lens was worn over the right eye in 30 fourweek old pigmented guinea pigs. The eyes were periodically examined by retinoscopy, and Ascan ultrasonography. Two weeks later, the eyeballs were removed and the apoptotic cells were determined by electron microscopy, TUNEL technique and flow cytometry in scleras. Both bFGF and the bcl2 protein were determined by the immunohistochemisty method and the Westernblot method. Results: All eyes treated with -10.00D or -20.00D concave lens produced defocusinduced myopia. Axial lengths in lensinduced eyes remarkably increased compared with control eyes. Apoptotic cells were observed in fibroblasts of sclera in lensinduced eyes, much more than in control eyes (P＜0.01). Expression of the bFGF and bcl2 protein was decreased (P＜0.01). With an increase of the diopter in the lensinduced myopia of guinea pigs, expression of bFGF and bcl2 was decreased. Conclusion: bFGF and bcl2 may play critical roles in guinea pig′s sclera with lensinduced myopia by adjustment of the apoptosis.
［KEY WORDS］ Myopia; Apoptosis; Fibroblast growth factor2; Bcell lymphoma/leukemia 2; Sclera
实验性近视眼主要分为透镜诱导近视（lensinduced myopia,LIM）和形觉剥夺性近视(form deprivation myopia,FDM),由于LIM被认为与人类近视眼有更多相似之处［1］,所以对该模型巩膜组织发生机制的探讨成为近视研究的重点。以往的研究中已经表明细胞凋亡在近视形成的过程中有一定的作用［2］,而碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）和凋亡抑制基因B细胞淋巴瘤/白血病2基因（Bcell lymphoma/leukemia 2 ，Bcl2）与细胞凋亡密切相关，本研究建立豚鼠的实验近视眼模型，应用电镜、流式细胞仪和终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导原位缺口末端标记法（TdTmediated biotin dUTP nickend labelling,TUNEL） 对凋亡的细胞作定性、定量检测。并应用免疫组织化学染色和蛋白印迹法（Westernblot）对透镜诱导豚鼠近视眼的巩膜组织进行bFGF和Bcl2蛋白的检测，探讨bFGF和Bcl2在实验性近视眼中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 近视模型制作 选择4周龄的健康花色豚鼠45只(山东大学实验动物中心提供)，随机分为3组，每组15只，Ⅰ组豚鼠右眼戴-20D透镜，Ⅱ组右眼戴-10D透镜，Ⅲ组为正常对照组，双眼均不处理。室内饲养,自然昼夜周期,室温24 28?℃。
1.2 眼屈光度的测量 Ⅰ、Ⅱ组豚鼠戴透镜前和戴透镜2周后检查眼屈光度，双眼滴0.5%托比卡胺眼水以麻痹睫状肌,30?min后，用带状光检影镜测眼屈光度，用A超测量眼轴长度。
1.3 组织的取材与分离 将3组豚鼠注射空气处死，于角膜的中央水平径线处的鼻侧和颞侧角膜缘作标记，沿角膜缘剪开球结膜，立即摘除双侧眼球，沿角膜垂直径线剪开，1/4眼球置入快速固定液中固定；1/4眼球用剪刀沿赤道部环行剪开眼球壁，去除眼前节组织和玻璃体，用无齿镊剥离巩膜，取后极部巩膜组织3?mm×3?mm一块，置入25?g/L戊二醛溶液中固定,备于电镜检查；1/4眼球用于Westernblot检测；另1/4眼球用于流式细胞仪检测。
1.4 TUNEL技术检测巩膜凋亡细胞 TUNEL试剂盒购于福州迈新公司，操作步骤严格按说明书进行。切片常规脱蜡、水化，3%过氧化氢封闭内源性过氧化物酶。蛋白酶K消化后，在末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT）作用下把地高辛标记的脱氧尿苷酸连接到凋亡细胞DNA的3′OH末端，再用生物素化地高辛抗体放大信号，DAB显色。苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，光镜观察。TUNEL染色阳性对照片为DNase 1?mg/ml作用10?min;阴性对照为反应液中不加TdT。
1.5 电镜观察 每组随机选3只眼球，取眼球后部颞侧眼球壁巩膜组织切成1?mm×1?mm大小组织块,25?g/L戊二醛溶液中固定,10?g/L锇酸固定,各级酒精及丙酮脱水,浸透包埋、固化,超薄切片(50 60?nm),枸橼酸铅染色,JEM1200EX透射电镜观察、拍片。
1.6 流式细胞仪检测巩膜的凋亡细胞 剥离的后极部巩膜PBS漂洗后，放入盛有适量PBS的平皿中，剪碎组织块，吸管吹打，0.25%胰蛋白酶消化，200目筛网过滤，1?000?r/min离心0.5?min，去上清，PBS洗涤，调细胞浓度为1×106个/ml, 用荧光素标记的连接素V/碘化丙啶(AnnexinVFITC/PI)染色，流式细胞仪检测。
1.7 免疫组织化学检测bFGF和bcl2 兔抗bFGF和bcl2多克隆抗体及SABC试剂盒购于福州迈新公司。染色步骤按SABC试剂盒内说明书进行，兔抗bFGF和bcl2多克隆抗体工作浓度为1∶100，由福州迈新公司提供的bFGF和bcl2的阳性组织片作阳性对照。以PBS代替一抗，作阴性对照。
1.8 bFGF和bcl2蛋白印迹法检测 在冷的RIPA缓冲液中处理3组眼球剥离的后极部巩膜，置于含有酶抑制剂的细胞溶解缓冲液(150?mmol/L NaCl、1NP40、0.5去氧胆酸及50?mmol/L Tris HCl,ph8.0)中,室温下1?h,离心10?min(13?000?r/min),取上清液,检测蛋白浓度。
将同一蛋白浓度的待测标本、阳性对照及阴性对照样本煮沸3?min,分别加入4% 15%十二烷基硫酸钠的聚丙烯酰胺凝胶,电泳45 60?min(电压200?Ｖ)。将带有蛋白带的凝胶转移至硝酸纤维膜,在90?Ｖ电压下转移1?h,将其置于3%无脂牛奶中1?h(去除非特异性染色)后取出,加第1抗体(抗体稀释液:1%小牛血清、Tris盐溶液、0.5Tween20)于硝酸纤维膜,室温下1?h,漂洗3次后加HRP标记的抗1抗体,再置室温1?ｈ,漂洗3次,用放射自显影法显影检测bcl2、bFGF蛋白条带，Kodak X胶片摄影。Western blot方法显示的蛋白带密度直观进行比较后，用ECL增强检测系统检测强度并经电脑分析。
1.9 结果判定 由2名病理科医生采用双盲法独立观察，每张切片观察10个视野，bFGF和bcl2的阳性效应产物为棕黄色颗粒，分布于后极部巩膜组织细胞浆中。TUNEL结果判断及标准: TUNEL (POD)阳性细胞着色为棕黄色，定位于胞核内,少数胞浆内出现阳性颗粒。TUNEL染色阳性且在光镜下符合凋亡细胞形态特征：胞质、染色质浓缩，体积缩小。TUNEL阴性细胞为细胞核无棕色着色。利用HPIAS1000高清晰度彩色病理分析系统，用彩色分割方式测定每个视野中的阳性细胞面积，计算阳性细胞面积占每个视野组织面积的百分比。应用凝胶分析系统软件对蛋白含量作定量分析，扣除背景荧光，最终结果为bFGF和bcl2 蛋白与内对照βactin比值的平均值。
1.10 统计学处理 采用SAS统计分析软件对透镜诱导豚鼠近视屈光度和眼轴结果行t检验。 对3组凋亡率、bFGF和bcl2免疫组化阳性率及westernblot结果，应用配对t检验进行统计学分析。
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