作者：任孝伟    作者单位：中国人民解放军第242医院眼科，辽宁 沈阳 110000

　　【摘要】目的：探讨兔眼晶状体皮质吸出术后不同时期MMP-2、MMP-9的变化，推断其在后发性白内障形成过程中的作用。方法：选用中国医科大学实验动物部提供的白色家兔42只，随机分成实验组（35只）及对照组（7只）。实验组肌肉注射氯胺酮15mg/kg进行麻醉，由专人行双眼透明晶状体皮质吸出术。术后1%阿托品眼膏散瞳双眼，分别于术后1周、1、2、3、5个月各处死7只兔；对照组不做处理，直接处死。石蜡标本进行免疫组织化学定位检测MMP-2、MMP-9，冷冻标本用Zymography方法进行MMP-2、MMP-9活性测定。结果：①兔眼后发性白内障形成情况：术后不同时期裂隙灯下观察可见术后前3d前房内炎症反应明显，虹膜充血；术后1周可见前囊截缘出现白色环状混浊，但后囊尚透明；术后2周后囊呈薄纱状；1个月出现线条状混浊，2～3个月成条索状混浊，术后5个月后囊明显混浊。②免疫组化结果：对照组晶体上皮细胞胞浆及细胞间质中没有明显的MMP-2、MMP-9表达，实验组MMP-2于术后1～3个月表达增强。③Zymography凝胶检查：对照组可检测到极低的MMP-2、MMP-9活性（呈淡条带）；实验组MMP-2活性明显强于对照组，MMP-9无明显差异。④活性分析：对照组MMP-2活性为（0.75±0.10），实验组分别为（3.68±0.12）、（5.18±0.11）、（5.62±0.11）、（6.58±0.11）和（1.19±0.10）；实验组MMP-9活性与对照组相比无显著性差异。结论：正常兔晶体囊膜中有MMP-2、MMP-9活性；术后2～3个月囊膜中MMP-2活性增强；术后2～3个月，囊膜中MMP-9无变化；MMP-2与MMP-9比较，前者与后发性白内障的发病关系更密切。

　　【关键词】  基质金属蛋白酶；后发性白内障；晶体上皮细胞

　　Different expression of MMP-2 and MMP-9 in formation of posterior capsule opacification

　　REN Xiao-wei

　　Department of Ophthalmology, No.242 Hospital of PLA,shenyang 11000,China
   
　　Abstract：ObjectiveTo discuss the changes of MMP-2 and MMP-9 level in different stages after cortex exsuccation of lens in rabbits and their effect in the formation of posterior capsule opacification. MethodForty-two healthy white rabbits from the experimental animal department of CMU were divided into the test group (n=35) and the comparison group (n=7) randomly. Ketamine was intramuscular injected for anaesthesia (15mg/kg) and cortex exsuccation of lens was performed on two eyes in the test group, mydriasis with 1% atropine after operation. 7 rabbits were executed 1 week，1 month，2 months ,3 months and 5 months after the operation respectively. Rabbits in the comparison group were executed with no operation. Zymography test and immunohistochemical technique were used separately to determine the activity of MMP-2 and MMP-9 of the paraffine sample and the refrigeration sample. Results①The formation of posterior capsule opacification in rabbit eyes: observation in different stages after the operation showed the inflammatory response remarkable at the first three days with iris congestion; edge of anterior capsule circularity opacification at the 1st week, but no remarkable change in the posterior capsule; just gauze-like at the 2nd week; strip-like opacification at the end of the 1st month, funicular opacification after 2～3 months, while visible opacification at the 5th month after the operation. ②Results of immunohistochemical technique: there was no obvious expression of MMP-2 and MMP-9 in lens epithelia and stroma in the comparison group, while higher expression of MMP-2 in 1～3 months after the operation in the test group. ③Zymography test: low expression of MMP-2 and MMP-9 in the comparison group;the activity of MMP-2 in the test groups was stronger than that of the comparison group; but there was no remarkable difference of MMP-9. ④Analysis of activity: the activity of MMP-2 in the comparison group was (0.75±0.10)， and (3.68±0.12)，(5.18±0.11)，(5.62±0.11)，(6.58±0.11)，(1.19±0.11) in the test groups respectively. But there was no remarkable difference of MMP-9 between the two groups. ConclusionMMP-2 and MMP-9 expression is found in normal lens capsule and MMP-2 expresses highest in 2～3 months after cortex exsuccation of lens. No change in the expression of MMP-9 in lens capsule 2～3 months after operation and MMP-2 plays a more important part in the formation of posterior capsule opacification than MMP-9.
   
　　Key Words：Matrix metalloproteinase；Posterior capsule opacification；Lens epithelia

　　细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是存在于细胞之间的动态网状结构，不仅构成细胞外的网架结构，而且对组织细胞的迁移、分化、增殖等生理过程和炎症、新生血管等病理过程均有重要作用。病理状态下ECM的产生和(或)降解失衡引起其过多堆积，进而导致一系列分子、细胞水平和组织病理学方面的改变，产生相关的疾病［1］。研究表明，后发性白内障的产生很可能和ECM的产生和降解失衡相关。基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）是一组能降解细胞外基质成分的重要内源性蛋白分解酶，其在ECM产生和降解的动态平衡、创伤修复和组织重建中有重要作用，在组织纤维化中的作用近年来备受关注［2］。后发性白内障的产生和发展可能与MMPs有关，正常组织中MMPs表达量极少，在兔眼晶体术后的房水MMPs动态变化研究中，MMP-2、MMP-9均有不同程度的变化［3］。晶体手术后，因晶体上皮细胞游走、迁移、分化，常不可避免地引发后发性白内障，为探讨MMP-2、MMP-9与后发性白内障形成的关系，我们采用Zymography技术和免疫组化技术对兔晶体皮质吸出术后不同时期残存在晶体囊膜上的晶体上皮细胞及细胞间质进行MMP-2、MMP-9的活性及定位检测，以期得出相应的结论。

　　1  材料与方法 

　　1．1  实验材料

　　1．1．1  试剂：7.5%SDS-PAGE胶（含1.0mg/ml明胶）；2.5%Triton-X100；考马斯亮蓝R250染色剂。鼠抗人MMP-2多克隆抗体（迈新公司）、MMP-9单克隆抗体（SantaCruz公司）；小鼠IgG链霉亲和素生物素复合免疫组化试剂盒；二氨基联苯胺（Diaminobenzidin，DAB）显色试剂盒（武汉博士德公司）。

　　1．1．2  仪器及分析软件：CV-8000型超声乳化仪（日本NIDEK公司）；日本TAKAGI手术显微镜；国产DYY-III5型电泳仪；国产DYY-III28C型电泳槽；美国QUEUE恒温湿箱；国产LKB2219型恒温水浴箱；英国UVP公司的GDS8000凝胶成像及分析系统。

　　1．2  实验方法

　　1．2．1  兔后发性白内障模型的建立及标本制作：选用中国医科大学实验动物部提供的白色家兔42只，体重0.9～1.1kg，雌雄不限，随机分成实验组35只及对照组7只。实验组兔肌肉注射氯胺酮15mg/kg进行麻醉，由专人行双眼透明晶状体皮质吸出术：3.2mm角巩膜缘切口，前房注入粘弹剂，形成5mm直径的开罐式截囊，水分离囊下晶体皮质，注吸档抽吸皮质，切口不缝合。术后1%阿托品眼膏散瞳双眼，分别于术后1周、1、2、3、5个月各处死7只兔；对照组不做处理，直接处死。摘除眼球，剪除角膜、虹膜，断晶体悬韧带，取出晶体后立即将各组的2只兔的4只晶体用4%多聚甲醛固定24h，石蜡包埋；各组的另5只兔的10只晶体在显微镜下剥出晶状体残存的囊膜（包括5mm以外的前囊及全部后囊），称湿重，置-70℃冷冻保存。

　　1．2．2  免疫组织化学SP法检测MMP-2、MMP-9：石蜡标本连续切片，片厚5μm，常规梯度酒精脱蜡，PBS冲洗，加3％H2O2室温静置6min，封闭内源性过氧化物酶，柠檬酸缓冲液热修复，滴加正常山羊血清封闭后，加1∶100稀释的MMP-2、MMP-9抗体，4℃冰箱过夜，次日依次加二抗孵育1h，辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素孵育1h，充分清洗后，DAB显色。镜下观察显色情况，蒸馏水中止显色，苏木素复染，常规脱水透明，中性树胶封片。

　　1．2．3  ZymograPhy技术检测MMP-2、MMP-9：将上述各组-70℃冷冻保存的晶状体囊膜剪碎，与匀浆缓冲液混合均匀、离心，并用匀浆缓冲液调整致相同最低总蛋白浓度。样本及样本缓冲液以1∶1比例混合后取样［4］。ZymograPhy测定：以7.5%SDS-PAGE胶（含1.0mg/ml明胶）作为分离胶，30mA恒流电泳6h，电泳后凝胶与2％TritonX-100中浸泡1h，然后在Ph7.5溶液中37℃孵育40h，考马斯亮蓝R250染色5h，脱色液脱色24～48h，干燥封胶。为了尽量减小误差，每组的两个样本多次重复实验。

　　1．2．4  图像分析：利用UVP公司的GDS8000凝胶成像及分析系统对Zymography电泳结果进行灰度扫描，通过测定电泳条带的积分吸光度（A）值，对各组的酶活性进行比较，结果采用t检验。

[1] [2] 下一页