周庆军   王晔   高彦   史伟云   谢立信

山东省眼科研究所   266071

目的：探讨人角膜内皮细胞体外增殖困难的原因。

方法：采用组织块法培养人角膜内皮细胞，牛角膜内皮细胞核人角膜基质细胞采用酶消化法进行分离培养。细胞传至不同代数后行β-半乳糖苷酶染色、定量PCR和免疫细胞化学检测。

结果：人角膜内皮细胞体外连续培养传3代后，细胞形态发生明显变化，逐渐丢失了原来典型的铺路石样外观，细胞体积增大、更为铺展，细胞质内出现空泡。与原代人角膜内皮细胞相比，β-半乳糖苷酶染色多呈强阳性，免疫细胞化学检测发现细胞高表达P16（一种典型的细胞衰老标志），Ki67（细胞增殖标志）的表达明显变弱，定量PCR检测发现，除P16和Ki67的表达与免疫细胞化学结果类似外，P3代的人角膜内皮细胞高表达SOD2，说明细胞出现衰老可能是由于体外细胞培养造成的氧化应激所致。但人角膜基质细胞在体外连续传代30代后才出现明显的β-半乳糖苷酶阳性染色，而牛角膜内皮细胞连续传代45代未见明显的变化。

结论：体外培养的人角膜内皮细胞更易衰老，这可能与人角膜内皮细胞体外扩增困难有关。