体外培养的晶状体上皮细胞株的确定及生长、分化规律

眼科新进展 1999年第4期第19卷 研究原著

作者：吴　强　陆道炎　王丽天　陈才根

单位：200092　上海第二医科大学附属新华医院眼科

关键词：晶状体上皮细胞；细胞培养；细胞分化

　　摘要　目的　建立牛、兔、人晶状体上皮细胞的体外培养，进一步认识晶状体上皮细胞生长、分化规律。方法　应用组织块培养方法进行3种晶状体上皮细胞的体外培养，经Gimsa染色，在倒置显微镜下对培养的晶状体上皮细胞的生长、分化规律进行观察。结果　培养至6wk的人胎儿晶状体上皮细胞中有特征性的“晶状体小体”形成；牛、兔晶状体上皮细胞去分化是发生在第3代，而人晶状体上皮细胞在第4代开始出现去分化；它们传代至第8代时生长都趋于停止，出现老化表现；来自人的晶状体上皮细胞生长增殖率与年龄呈负相关关系(r=-0.996)。结论　“晶状体小体”的形成可作为确定晶状体上皮细胞株的一项特征性依据，而体外培养的人、牛、兔晶状体上皮细胞具有相同的有限生长潜能，在相同的条件下，牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞快，但易于发生去分化；此外，人晶状体上皮细胞的生长增殖率与年龄密切相关，年龄越小，晶状体上皮细胞的生长增殖速度越快。

Study on identification and differentiation of lens epithelial cells lines in vitro

　　WU Qiang　LU Dao-Yan　WANG Li-Tian　CHEN Cai-Gen

　　Key words　lens epithelial cell;cell culture;cell differentiation

　　Abstract　Objective　To establish bovine,rabbit and human lens epithelial cells(LEC)culture and further understand the differentiation of LEC.Methods　LEC from bovine,rabbit and human were cultured using tissue explant technique in vitro;The differentiation of LEC cultured from the three species was observed by Gimsa staining and a inverted microscope.Results　LEC from fetus maintained in culture longer than 6 weeks spontaneously formed lens-like spherules.Under identical conditions,a average doubling time of LEC from bovine,rabbit and fetus during the logarithmic phase was 24h,24.5h and 26h respectively;Dedifferentiation of cultured LEC from bovine and rabbit began after the third passage;and dedifferentiation of LEC from human occurred after the fourth passage;Cultued LEC from the three species exhibited apperant senescence at the eighth passage.The proliferative capacity of LEC from human had directly relevance to the age of donor(r=-0.996).Conclusions　The formation of lens-like spherules is characteristics of LEC lines in the cultured cells.Under identical conditions,the proliferative rate of LEC from bovine and rabbit is fast than that of LEC from human,but dedifferentiation of LEC from bovine and rabbit is easier than that of LEC from human;LEC from the three species exhibit similar limited growth potential.The proliferative rate of LEC from human has a inversely proportion with age.

　　眼晶状体组织中，晶状体上皮细胞是一群代谢活跃，具有生长、分化和创伤刺激后发生愈合反应能力的细胞结构。晶状体上皮细胞的体外培养是观察晶状体上皮细胞生长的形态、功能变化的基础，也是为进一步从分子水平研究晶状体上皮细胞的生物学特性提供实验对象的重要实验方法。本研究在建立牛、兔、人晶状体上皮细胞体外培养的基础上，观察3种不同种属来源的晶状体上皮细胞在体外的生长、分化规律，同时也为相关实验研究所采用的实验对象的科学性、合理性提供可靠的理论依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　试剂和仪器　主要试剂：美国GIBco BRL公司生产的DMEM培养液、胎牛血清。美国DIFco公司生产的胰蛋白酶。Gimsa染液：实验室内自行配制。主要仪器：日本产Olympus倒置显微镜、Olympus-PM6照相机、CO2培养箱。

　　1.2　LEC的体外培养

　　1.2.1　标本来源　新生小牛眼和1mo的新西兰白兔分别由牧场和本院动物房提供；胎儿晶状体取自水囊引产死亡时间不超过6～8h的胎儿；而成人晶状体则取自角膜移植术后的供眼，供眼均来自男性，年龄分别为18a、42a、56a。

　　1.2.2　原代培养　用750mL．L-1的酒精和无菌生理盐水分别对所取眼标本消毒及冲洗3次，在无菌操作条件下，剪去角膜和虹膜；用截囊针将前囊膜取下，剪成1mm×1mm大小的碎片，加入1mL胎牛血清，用吸管将其混悬液移至培养瓶中，让细小的囊膜组织片弥散铺于瓶底，静置于37℃的CO2培养箱内孵育，12～24h时，当囊膜片及散落的晶状体上皮细胞贴壁后，加入含有100mL*L-1牛血清的DMEM培养液，随后视细胞的生长速度可3～4d换液1次。当细胞长满瓶底时可进行传代培养，其中用一瓶已长满胎儿晶状体上皮细胞培养瓶进行长期培养观察。

　　1.2.3　传代培养　当原代培养细胞长满瓶底时，用D-Hanks液洗涤1次，加入自配的2.5g．L-1胰蛋白酶2mL。室温下晃动培养瓶3～5min，倒去大部分培养液，当见细胞呈碎屑样从瓶底脱离，倒置显微镜下见大部分细胞收缩、分离、脱壁后，加入含100mL．L-1小牛血清的DMEM培养液，用吸管吹打后，按1∶2的比例进行传代培养。

　　1.3　细胞生长的检测　将3种不同种属4种来源培养的第2代晶状体上皮细胞，按30×103细胞/孔的数量接种到24孔的培养板上，每组10孔，分别于接种后24、48、96、120h取2孔生长的细胞计数，每孔细胞计数3次，取均值，绘制生长曲线，求出倍增时间。

　　1.4　细胞形态和结构的观察　用倒置显微镜在×100、×200、×400的倍率下动态观察原代和传代培养的LEC生长、形态、以及胞内结构的变化。Gimsa染色法［5］用于观察培养的各种细胞的形态、晶状体小体结构、细胞内的结构。

　　2　结果

　　2.1　原代和传代培养　将4种不同来源3种不同种属的晶状体囊膜片置入培养瓶中培养，观察发现新生小牛、兔和胎儿的囊膜片在24～48h就有上皮细胞自囊膜片生长移出，而成人囊膜片在40～72h才可见有细胞自囊膜片生长移出，外观呈芽胞状(见图1)，近囊膜片处细胞生长密集，呈多角形。远离囊膜片处细胞生长稀疏，胞体延伸，培养的小牛、兔晶状体上皮细胞约需6～10d细胞发生融合长满瓶底，胎儿约需9～12d，成人约需11～14d；经消化后按1∶2传代的小牛、兔晶状体上皮细胞生长迅速，约3～4d细胞可达融合，融合后的细胞呈多角形、椭圆形，大小基本一致；胎儿晶状体上皮细胞生长稍有所缓慢，约6～8d细胞发生融合，经Gimsa染色见细胞呈上皮细胞样外观，胞体边界清，胞浆呈均匀的粉红色，以及呈紫红色的单或双核(图2)；而不同年龄的人晶状体上皮细胞生长更加缓慢，但形态一致，约需7～14d细胞才达到融合；传代至第3代，小牛、兔晶状体上皮细胞虽生长迅速，但部分细胞形态已呈现出梭形的成纤维细胞的外观(图3)，至第5代大部分细胞形态都发生了如此改变，胞内可见网状结构，第6～7代时，细胞生长缓慢，胞内网状结构增多，出现空泡样改变(图4)。第8代时，生长特别缓慢，胞内网状结构及空泡样改变明显增多；而胎儿和不同年龄人晶状体上皮细胞传代至第4代才可见细胞梭形样改变，在第6～7代时胞内也可见有网状结构及空泡样改变，第8代时，细胞也发生衰老。

　　Figure 1　The growth status of cultured primary human lens epithelial cells displayed at 40～72h，×200LM　原代培养的人晶状体上皮细胞(40～72h)生长情况，×200LM

　　Figure 2　The configuration of cultured primary fetus lens epithelial cells displayed，×200LM　原代培养的胎儿晶状体上皮细胞形态，×200LM

　　Figure 3　The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the third passage，×200LM　　第3代牛晶状体上皮细胞生长情况，×200LM

　　Figure 4　The growth status of bovine lens epithelial cells displayed at the seventh passage，×400LM　第7代牛晶状体上皮细胞生长情况，×400LM

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