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结果
一、培养细胞的细胞鉴定
原代培养6～28天细胞从组织块向外生长,6～8周细胞围绕在组织块周围形成单细胞层。传代培养24h后多数细胞已贴壁,2或3周细胞汇合形成单细胞层。汇合后的细胞均匀一致且数量衡定,细胞可稳定1或2个月,2个月后开始降解,可传至8或9代。光镜下见汇合前细胞形态呈三角形或梭形,汇合后细胞形成一单细胞层,胞突重叠,但胞体不重叠。扫描电镜下细胞表面有均匀分布的短状微绒毛和包涵体小囊突起。透射电镜下均可见各种细胞器丰富、核膜不明显,有黑色峰带状楔形异染色质位于核膜内侧。培养细胞的细胞外基质免疫组化S-P法染色显示LN和ⅣC阳性。综上所述,从培养细胞的生长特性、形态特征和LN、ⅣC阳性S-P法染色特点确定培养的细胞为人眼小梁细胞。
二、TGF-β1对培养的人眼小梁细胞微丝肌动蛋白的影响
从张力纤维束形态、F-肌动蛋白含量及β-肌动蛋白mRNA表达强度3方面分析。张力纤维束构成微丝,F-肌动蛋白组成张力纤维束,β-肌动蛋白是F-肌动蛋白的基本成分。
1.张力纤维束形态:TGF-β1各浓度组与对照组比较,随着作用时间的延长而张力纤维束增多,各时间组随着浓度升高而不增多,加有中和抗体者不增多。高浓度、作用时间延长者汇合前细胞生长增殖抑制,细胞膜破裂,细胞脱落。
2.F-肌动蛋白含量:流式细胞计检测每个样品的相对荧光强度，即为一定细胞数所含F-肌动蛋白的含量。经统计学处理,各浓度组与对照组的F-肌动蛋白含量比较,差异均有显著性(P＜0.01);各浓度组随着作用时间的延长含量增加(r=0.889,P＜0.05);而各时间组随着浓度升高含量不增加(r=0.675,P＞0.05);加有TGF-β1中和抗体者含量不增加(P＞0.05)。
表1 TGF-β1各相对质量浓度中20个样品不同时间的细胞数和相对荧光强度参数
| TGF-β1
相对质量浓度
(ng/ml) |
6h |
12h |
24h |
48h |
| 细胞数 |
荧光强度参数
( ±s) |
细胞数 |
荧光强度参数
(±s) |
细胞数 |
荧光强度参数
(±s) |
细胞数 |
荧光强度参数
(±s) |
| 0 |
7032 |
38.70±2.90 |
6204 |
41.34±2.50 |
4990 |
37.88±2.14 |
2813 |
38.99±3.01 |
| 0.5 |
7717 |
100.58±2.50 |
6365 |
123.38±2.24 |
7670 |
132.63±2.85 |
6139 |
158.86±2.30 |
| 1 |
6615 |
120.20±2.66 |
5341 |
155.13±2.47 |
5666 |
161.37±2.12 |
7417 |
171.43±2.03 |
| 5 |
6549 |
159.86±2.75 |
4658 |
183.93±2.00 |
7570 |
194.21±3.05 |
4999 |
206.71±3.41 |
| 1+Ab |
6521 |
40.12±2.89 |
5300 |
39.88±2.10 |
7083 |
40.10±2.70 |
6720 |
36.12±2.98 |
3.β-肌动蛋白mRNA表达强度:每个样品的细胞计数和RNA提取实验重复4次取其平均值。24个样品细胞数平均为3107万个,细胞RNA含量平均为81.43μg(表2)。每个样品的RNA电泳带清晰,OD值均为1.9。在进行RT-半定量PCR实验之前,首先确定β-肌动蛋白和内参照G3PDH二者PCR产量的对数增长期。在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前为β-肌动蛋白的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/ul、33循环数以前为G3PDH的PCR产量的对数增长期;在RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、30循环数以前均为β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量的对数增长期。因此,选择RNA相对质量浓度为2.25μg/μl、28循环数进行RT-半定量PCR实验(表3)。24个样品每次实验均为同批实验品，重复3次,但重复实验时可能由于非同批实验品造成的差异性,使每个样品在3次实验中的β-肌动蛋白和G3PDH的PCR产量各不相同，但3次实验中β-肌动蛋白/G3PDH的PCR产量的比值一致性达到0.1。24个无RNA的阴性对照样品重复3次均为阴性(图8，9)(表4)。
表2 TGF-β1各相对质量浓度中24个样品不同时间的细胞数和RNA含量
| TGF-β1
相对质量浓度
(ng/ml) |
3h |
6h |
12h |
24h |
36h |
48h |
| 细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
细胞数
(104) |
RNA
(μg) |
| 0 |
3036 |
79.6 |
3175 |
83.2 |
3103 |
81.3 |
3085 |
80.9 |
2982 |
78.2 |
3175 |
83.2 |
| 0.5 |
3047 |
79.7 |
3129 |
82.0 |
3126 |
81.9 |
3017 |
79.1 |
3255 |
85.3 |
3049 |
79.9 |
| 1 |
3164 |
82.9 |
3082 |
80.8 |
3122 |
81.8 |
3035 |
79.6 |
3055 |
80.1 |
3083 |
80.8 |
| 5 |
3209 |
84.1 |
3095 |
81.1 |
3217 |
84.3 |
2990 |
78.4 |
3085 |
80.9 |
3244 |
85.0 |
表3 不同RNA浓度各循环数的PCR产量参数(μg/μl)
| RNA浓度
(μg/μl) |
各循环数的PCR产量参数 |
| 15 |
18 |
21 |
24 |
27 |
30 |
33 |
36 |
| β-肌动蛋白 |
| 18 |
0.286 |
0.582 |
1.168 |
2.322 |
4.140 |
4.620 |
4.638 |
4.641 |
| 2.25 |
0.208 |
0.290 |
0.581 |
1.166 |
2.321 |
4.638 |
4.620 |
4.637 |
| 1.15 |
- |
0.210 |
0.300 |
0.586 |
1.167 |
2.322 |
4.640 |
4.638 |
| G3PDH |
| 18 |
0.204 |
0.282 |
0.578 |
1.162 |
2.326 |
4.640 |
4.639 |
4.642 |
| 2.25 |
- |
0.209 |
0.292 |
0.582 |
1.168 |
2.322 |
4.642 |
4.639 |
| 1.15 |
- |
- |
0.212 |
0.301 |
0.581 |
1.168 |
2.318 |
4.640 |
| 2.25 |
0.212 |
0.294 |
0.584 |
1.164 |
2.324 |
4.640 |
4.639 |
4.642 |
| β-肌动蛋白+
G3PDH |
- |
0.210 |
0.293 |
0.584 |
1.170 |
2.324 |
4.640 |
4.638 |
注：“-”示未取得数据
表4 TGF-β124个样品细胞数β-肌动蛋白/G3PDH比值参数
| TGF-β1
相对质量
浓度(ng/ml) |
不同时间的β-肌动蛋白/G3PDH比值参数 |
| 3h |
6h |
12h |
24h |
36h |
48h |
|
0 |
1.3175 |
1.2678 |
1.2725 |
1.2768 |
1.2762 |
1.2980 |
| 0.5 |
1.8410 |
1.8471 |
3.0654 |
3.6724 |
4.1172 |
4.2804 |
| 1 |
2.8154 |
2.8292 |
4.0947 |
4.1943 |
4.2692 |
4.4324 |
| 5 |
2.8328 |
2.9286 |
4.3951 |
4.4504 |
4.5141 |
4.8402 |
经统计学处理,各浓度组与对照组的β-肌动蛋白mRNA表达强度比较,差异均有显著性(P＜0.001);各浓度组随着作用时间的延长表达增强(r=882,P＜0.001);各时间组随着浓度的升高表达不增强(r=0.672,P=0.05)。TGF-β1对转录水平β-肌动蛋白mRNA表达增强的影响与对蛋白水平F-肌动蛋白含量增加的影响结果一致。
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