中华眼科杂志 1999年第3期第35卷 论著
作者：牛膺筠 严瑛 纪建中 罗兵
单位：牛膺筠 严瑛 纪建中(266003青岛大学医学院附属医院眼科)；罗兵(青岛大学医学院微生物教研室)
关键词：聚合酶链反应；多态性；限制性片段长度；p53基因；眼部鳞状细胞癌
【摘要】 目的 探讨眼部鳞状细胞癌发生的分子生物学机制。方法 采用聚合酶链反应――限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）方法，对63例患者的送检标本（包括36例浸润性鳞状细胞癌，7例原位癌，20例乳头状瘤）中p53基因248位点的突变进行检测。结果 22.2%(8/36)的浸润性鳞状细胞癌及14.3%（1/7）的原位癌中有p53基因248位点的突变，而在乳头状瘤中则未检测到，差异有显著性（P=0.021）。70岁以上的患者中未发现p53基因的突变，70岁以下突变率为33.3%，差异有显著性（P=0.024）。p53基因突变与眼部鳞状细胞癌临床病理特征无关（P＞0.05）。结论 p53基因突变在眼部鳞状细胞癌的发生早期起一定作用，与临床病理特征无关。在70岁以上的老年患者中p53基因突变不是肿瘤发生的主要原因。
A study of p53 gene mutations in squamous cell carcinoma in eyes NIU Yingjun, YAN Ying, JI Jianzhong, et al. Department of Ophthalmology, The Affiliated Hospital, Qingdao Medical College, Qingdao 266003
【Abstract】 Objective To inquire into the molecular biological mechanisms of the occurrence of squamous cell carcinoma in eyes.Methods Using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method, we detected 63 samples taken from 63 cases (including 36 invasive squamous carcinoma, 7 carcinoma in situ, 20 papillomas) for 248 point mutations in p53 gene.Results 22.2% (8/36) squamous cell carcinomas, 14.3% (1/7) carcinomas in situ were shown to contain the point mutation in codon 248 of p53 gene exon 7 and no point mutation was found in papillomas, the difference being significant (P=0.021). No point mutation was in patients over 70, while in patients younger than 70, the mutation rate was 33.3%, the difference being significant (P=0.24). No significant correlation was found between p53 gene mutations and clinical pathological manifestations (P＞0.05).Conclusions p53 gene mutations play roles in the early stage of the development of squamous cell carcinomas, and there is no correlation between p53 gene mutations and clinical manifestations. The mutation in p53 gene is not the main cause of neoplasms in the elder persons after the seventh decade of life.
【Key words】 Polymerase chain reaction Polymorphism, restriction fragment length p53 gene Squamous cell carcinomas in eyes
肿瘤的发生是多种因素共同作用的结果。目前在人类肿瘤中已发现许多癌基因的激活表达，并克隆鉴定出许多抑癌基因。其中p53肿瘤抑制基因在人类肿瘤中的频发失活令人瞩目。p53基因突变是导致p53蛋白功能失活最常见的机制。目前，在人体许多部位的鳞状细胞癌中已检测到野生型p53基因的突变。而p53基因突变在眼部鳞状细胞癌发生中的作用目前尚不明了。为此我们采用多聚酶链反应――限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphisms，PCR-RFLP）方法，对眼部鳞状细胞癌p53基因的点突变进行检测，以期探讨p53基因点突变在眼部鳞状细胞癌发生中的作用。
材料与方法
一、标本收集
选择本院眼科病理室1981～1997年间石蜡包埋的送检标本63例。其中包括36例浸润性鳞状细胞癌（简称浸润性鳞癌，指癌病变已突破上皮层基底膜），7例角膜、结膜原位癌（指病变未突破上皮层基底膜），20例乳头状瘤（细胞呈乳头状增生，未见癌细胞）。上述组织标本均经病理证实。
二、仪器、材料和试剂
1．仪器：DNA扩增仪4800型（美国PE公司产品），微量移液器（法国Gilson公司产品）。
2．试剂：采用美国Promega公司生产的PCR反应体系［Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷酸dNTP（dATP、dGTP、dTTP、dCTP总称）、10×buffer反应液、氯化镁MgCl2］，限制性核酸内切酶MSPⅠ，酶切缓冲液，Mark100bp ladder，蛋白酶K。琼脂糖（德国宝灵曼公司产品），p53基因第7外显子引物（美国CyberSyn公司合成）。
三、DNA抽提
石蜡标本切成10μm厚的蜡屑5～10片，置于1.5ml离心管中。切片时注意清洁切片刀，防止标本间DNA污染。经二甲苯脱蜡，无水乙醇洗涤，乙醇梯度水化。蛋白酶K裂解液（10mmol/LTris Ph8，5mmol/L EDTA，300μg/ml蛋白酶K，0.5%SDS）50～100μl消化，过夜。常规行酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提。取上层水相于干净离心管中，加入1/10体积（约1滴）3mol/L冰醋酸钠（NaAc）及2倍体积预冷无水乙醇，沉淀DNA。-20℃过夜。沉淀物于室温下干燥，加入30μl去离子水，溶解DNA沉淀，4℃贮存，备用。
四、p53基因PCR扩增及限制性酶切
1．p53基因第7外显子引物序列［1］：
Primer1：5’-CCC AAG GCG CAC TGA CCT CA-3’（20bp）
Primer2：5’-GCT CCT GAC CTG GAG TCT TC-3’（20bp）
扩增片段长164bp。野生型p53基因第7外显子248位点为限制性核酸内切酶MSPⅠ的酶切位点（CCGG-MSPⅠ酶切位点）。PCR产物经此酶酶切后电泳，在琼脂糖凝胶上可观察到113bp和51bp两条核酸电泳条带。若相应酶切位点的核苷酸出现变化，则不能被酶切，只能观察到总长度为164bp核酸对的电泳带，即为突变型p53。
2．扩增条件：反应总体积30μl。反应体系包括：10×buffer反应液3μl，dNTP终浓度1.5mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，引物终浓度0.6μmol/L，模板8μl，加入去离子水至终体积30μl。混匀后离心，加无菌石蜡油覆盖液面。置DNA扩增仪。反应条件：94℃变性45s，55℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环数。最后72℃延伸5min。PCR产物用氯仿抽提一次备用。
3．酶切条件：取PCR产物18μl，加入限制性内切酶MSPⅠ酶3U，37℃水浴1.5h。分别取PCR产物及酶切产物各10μl,以100bpmarkladder作为扩增片段长度标准，于含溴化乙锭（0.5μ?/ml）的2.5%琼脂糖凝胶电泳80V1h。由紫外光透射仪观察结果并摄像。
五、统计学分析
本文数据采用四格表精确概率法进行统计学处理，P≤0.05为差异有显著性。
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