中华眼科杂志 1999年第3期第35卷 论著
作者：何守志 王凤翔 顾峥 黄靖香 李楠
单位：何守志 王凤翔(100853北京,中国人民解放军总医院眼科)；顾峥 黄靖香(病理科)；李楠(仪器中心)
关键词：色素上皮；眼；激光
【摘要】 目的 观察在激光照射下,不同浓度的地塞米松及维拉帕米(verapamil)对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE）细胞间通讯功能的保护作用。方法 取10只猪眼球分离其RPE细胞行体外细胞培养,在激光照射前2h，采用不同浓度的地塞米松及维拉帕米分别孵育其第4代传代细胞,然后测定激光照射后光凝斑周围细胞间通讯功能。结果 125mg/L的地塞米松及20mg/L的维拉帕米均能在激光照射的情况下保护RPE细胞间通讯功能,而较高浓度的药物保护作用更大。结论 地塞米松和维拉帕米均能在离体条件下保护激光损伤后的RPE细胞间通讯功能,且其保护作用与用药浓度有关。
Protect intercellular communication of pigment epithelium after laser photocoagulation HE Shouzhi, WANG Fengxiang, GU Zheng, et al. Department of Ophthalmology, PLA General Hospital, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To observe the protective effect on the intercellular communication of retinal pigment epithelial (RPE) cells of dexamethasone (Dex) and verapamil (Ver) at different concentrations after laser photocoagulation.Method Ten pig eyes were used to culture pig pigment epithelium cells. Use different concentrations of Dex and Ver to incubate cultured RPE cells 2 hours before laser coagulation, and then measure the intercellular communication function of confluent cells surrounding the coagulation spots after photocoagulation.Result 125 mg/L Dex and 20 mg/L Ver could protect the intercellular communication of RPE cells under laser photocoagulation. The high concentration of drugs had better result.Conclusion Both Dex and Ver can preserve the intercellular communication in vitro. The protective capacity is related to the concentration of drug.
【Key words】 Pigment epithelium of eye Lasers
现代激光武器、医学领域、工业及实验室中对激光的广泛使用,使得眼激光损伤的危险因素明显上升。在临床上激光引起的视网膜损伤并不罕见,同时,激光武器对眼的损伤在海湾战争中也曾有报道［1］。文献报告,激光可对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞造成损伤［2，3］。为此，我们观察在激光照射下，不同浓度的地塞米松及钙离子阻滞剂-维拉帕米(verapamil)对RPE细胞间通讯功能的保护作用,并探讨其保护机制。
材料和方法
一、材料
1.动物：10只猪眼球，取自宰杀后的北京黑猪(北京清河第三肉联厂),均于死后2～3h内取材。修剪除眼球壁外周的软组织,用少量肥皂水刷洗,并用Hank液反复冲洗后，浸泡于含有200μg/ml庆大霉素的Hank液中备用。
2.主要仪器和试剂：(1)仪器：ACAS ULTIMA型激光扫描共聚焦显微成像仪(美国Meridien公司)。氩激光发射仪NOVUS-2000型(美国Coherent公司)。（2）试剂:5,6-碳氧荧光素醋酸盐(5,6-carboxyflorescein diacetate,CFDA)(美国Molecular Probes公司),以1mg/ml的浓度置于-20℃下保存。培养液由RPMI1640粉剂（美国Gibocoi laboratories)配制,内含庆大霉素80U/ml,卡那霉素1.0mg/ml,10%小牛血清pH值7.0～7.4。胰蛋白酶(上海东风试剂厂)用Hank液配成0.25%的溶液。地塞米松(江苏扬州制药厂)。维拉帕米(北京制药厂)。含钙、镁的Hank液,pH值7.4。
二、方法
1.细胞培养:参照文献［4］的方法,在无菌条件下自锯齿缘后剖开眼球,弃去前节,将后节眼球置于自制眼球托上,除去玻璃体及视网膜感觉部,后节眼杯用Hank液轻轻漂洗,0.25%胰蛋白酶消化15～20min,分离RPE细胞,经离心、漂洗后接种于RPMI1640培养液中,于37℃体积分数为5%的CO2孵箱中培养,原代RPE细胞达融合状态后，按1∶3传代培养,将第4代传代细胞接种于96孔培养板中,约2×104个细胞/孔,继续培养24h后细胞贴壁生长呈单层融合状态时备用。地塞米松组：光凝前2h在不同的培养孔中分别加入125、250及500mg/L的地塞米松；维拉帕米组：分别加入20、40及80mg/L的维拉帕米；空白对照组加Hank液。
2.激光照射损伤:参照文献［5］的方法,用裂隙灯发射系统argon蓝绿激光对RPE细胞进行照射,96孔板下放置黑纸作为背景,激光参数:输出功率900mW,光斑直径200μm,激光照射时间0.2s,每孔做20个光凝斑。
3.CFDA负载:贮备1mg/ml的CFDA，染色时用其稀释液。将96孔培养板中光凝后的RPE细胞用Hank液清洗2次,加入终浓度为30μmol/L的CFDA50μl。在37℃体积分数为5%的CO2孵箱中孵育15min,用Hank液清洗多余的CFDA,加培养液50μl,上机。
4.荧光光淬灭及恢复速率的观察:在激光扫描共聚焦显微镜下选定激光光凝斑周围的细胞作为观察范围,在此范围内选择周围与2个细胞紧密相连的单个细胞作为观察对象,另选一簇细胞不作淬灭处理，而作为背景校正,对所选定的单个细胞以高强度脉冲激光行荧光分子光淬灭,然后通过低强度激光扫描探测周围细胞非淬灭分子向淬灭细胞扩散速率。实时监测2min,计算机自动采集数据后计算荧光恢复速率平均百分率,并自动以背景校正荧光作为参考进行计算。
5.统计学处理方法：本文数据应用SAS软件进行统计学F检验。
结果
一、地塞米松对RPE细胞通讯功能的保护
不同浓度地塞米松组的细胞通讯功能与对照组比较，差异有显著性(F=62.81,P=0.0001),其中125mg/L组与250mg/L及500mg/L组比较，差异有显著性(P＜0.01),而后两组间比较，差异无显著性(P＞0.05)(表1)。
表1 激光照射后各组猪眼体外RPE细胞间通讯功能的比较
| 组别 |
细胞数 |
荧光恢复率
( ±s，%/min) |
| 对照组 |
13 |
1.382±0.569 |
| 地塞米松组 |
|
| 125mg/L |
14 |
2.315±0.528* |
| 250mg/L |
12 |
4.013±0.785*△ |
| 500mg/L |
12 |
4.267±0.577*△ |
| 维拉帕米组 |
| 20mg/L |
14 |
2.238±0.537* |
| 40mg/L |
14 |
3.617±0.812*△ |
| 80mg/L |
13 |
3.824±0.928*△ |
*与对照组比较，P=0.0001 △与本组第一个比较，P＜0.001 二、维拉帕米对RPE细胞通讯功能的保护
不同浓度维拉帕米各组间细胞的通讯功能与对照组比较，差异有显著性(F=33.62,P=0.0001),其20mg/L组与40mg/L及80mg/L组比较，差异有显著性(P＜0.01),后两组间比较，差异无显著性(P＞0.05)(表1)。
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