2　结果

　　结果判断：在显微镜下观察组织切片，将β-半乳糖苷酶基因表达分为3级：阴性(－)即无兰色酶反应，阳性(＋)即有兰色点状反应，强阳性(＋＋)即弥漫性兰色反应。

　　用药后2h，1组即玻璃体腔内注射DOSPER与pGME-7Zf（＋）质粒混合液的小鼠玻璃体腔内呈均匀一致的兰色反应(＋＋)，1组的眼球壁和其他4组小鼠眼球内均无β-半乳糖苷酶基因阳性表达(－)。

　　用药后1天，1组：角膜、虹膜、睫状体、视网膜节细胞层、内外核层及色素上皮层、脉络膜组织及玻璃体腔内均可见β-半乳糖苷酶基因阳性表达(＋～＋＋)。2组：角膜上皮细胞、内皮细胞、虹膜、睫状体、脉络膜及视网膜节细胞、光感受器均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。3组：角膜上皮细胞胞浆及胞核广泛呈兰色反应(＋＋)，角膜内皮细胞，虹膜有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋)，视网膜、脉络膜未见明显的兰色酶反应(－)。4组：虹膜、视网膜节细胞层存在β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。5组：眼球内无β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(－)。

　　用药后2天，1组：β-半乳糖苷酶基因阳性表达部位同用药后1天，但阳性表达细胞数明显增加，尤其以光感受器层的阳性表达(＋＋)增加最为明显。2组：角膜上皮细胞、角膜内皮细胞、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜节细胞层、光感受器层及色素上皮细胞均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)，与用药后1天相比，阳性表达细胞数明显增加。3组：角膜上皮、内皮细胞、虹膜、睫状体内有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)，与用药后1天相比，阳性表达细胞数无明显增加，但视网膜节细胞层及光感受器层均可见阳性表达(±～＋)，脉络膜未见阳性表达(－)。4组：角膜上皮、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜节细胞层、内核层、光感受器层和色素上皮层均有β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(＋～＋＋)。5组：眼球内各组织无β-半乳糖苷酶基因的阳性表达(－)。

　　用药后1周(图1，2)、2周、1月，所有5组的β-半乳糖苷酶基因表达情况与用药后2天相同。
　　3　讨论

　　研究结果表明，脂质体可转导外源基因到活体小鼠眼组织，如角膜、虹膜、睫状体、脉络膜、视网膜光感受器、视网膜节细胞和视网膜色素上皮细胞，不会导致眼球结构的改变和眼内炎症。由脂质体转导的β-半乳糖苷酶基因可在眼组织内表达至少1个月以上。通过玻璃体腔注射、尾静脉注射、表面点药及球后注射等不同途径给药，脂质体转导基因到眼组织，除表面给药组在脉络膜未看见到β-半乳糖苷酶基因的阳性表达外，其他β-半乳糖苷酶基因的阳性表达部位相同，仅有表达程度的差异。研究以脂质体做为载体转导外源基因入眼内组织，以及不同给药途径情况下，外源基因表达的部位，可为进行眼部疾病的基因治疗提供理论和实践依据。

　　成功的基因治疗取决于以下4个条件：选择适宜进行基因治疗的临床疾病；必须完全了解疾病的分子遗传学机制；给治疗部位导入理想基因的方法是可行的；须保证治疗基因在细胞内以适宜的水平进行表达［5］。以病毒作为载体，不论是宿主细胞范围广的腺病毒，还是对生长期细胞转移率较高的逆转录病毒及单纯疱疹病毒，它们均有可能对宿主细胞产生炎症甚至导致突变［6］，故此载体的种类已向非病毒介导载体发展，活体或离体的应用脂质体的可行性研究表明，脂质体能够介导外源基因进入哺乳动物细胞内，其外源基因转移率虽然略低于病毒载体，但它对组织和细胞毒性却远远低于病毒载体。本研究所用的商品化脂质体DOSPER是一种的阳离子脂质体，一定浓度对组织细胞无毒性并且无抗原性。本研究结果说明DOSPER可转导外源基因到活体小鼠眼组织不会导致眼球结构的改变和眼内炎症，也没有观测到明显的全身毒性。脂质体在眼组织中的作用机制有吞噬、融合，穿透和组织前破裂等方式。研究发现，局部滴眼的脂质体，除了通过角膜细胞的吞噬作用进入眼内以外，还有非角膜途径，即通过球结膜和它下面的巩膜进入眼内，因为结膜对脂溶性药物和大分子药物的通透性是角膜的20倍［7］。经玻璃体内注射途径到眼内的脂质体，多被细胞吞噬而被转入眼组织，这种方式有利于前体药物的活化。静脉注射脂质体，可使药物在视网膜动脉中释放，这属于组织细胞前破裂释放方式。脂质体介导裸基因进入细胞的原理，是通过包绕DNA，合成脂囊，与细胞表面的唾液酸结合，经细胞的胞饮或受体介导的胞饮作用进入细胞内。脂质体核苷酸在溶解酶体作用下降解，质粒DNA可移至细胞核内染色体。在活体眼内应用脂质体可增加角膜及其它眼组织的穿透力，提高药物的生物相容性；保护药物不受眼内酶的代谢；缓慢释放，减少药物毒性；同时携带外源基因入眼组织细胞内，辅助外源基因在组织细胞内表达。

　　本课题受上海市科学发展基金资助(基金编号：974119009)

　　1，Bird AC．Retinal photoreceptor dystrophies．Am J Ophthalmol，1995，119∶543
　　2，Anderson WF．Human gene therapy．Science，1992，256∶808
　　3，Pepose JS，Leib DA．Herpes simplex viral vectors for therapeutic gene delivery to ocular diseases．Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35∶2662
　　4，Abraham NG，da Silva JL，Lavrovsky Y，et al．Adenovirus-mediated heme oxygenase-1gene transfer into rabbit ocular tissues．Invest Ophthalmol Vis Sci，1995，36∶2202
　　5，Murata T，Kimura H，Sakamoto T，et al．Ocular gene therapy：experimental studies and clinical possibilities．Ophthalmic Res，1997，29∶242
　　6，Crystal RG．Transfer of genes to humans：early lessons and obstacles to success．Science，1995，270∶404
　　7，Wang W，Sasaki H，Chien DS，et al．Lipophilicity influence on conjunctival drug penetration in the pigmented rabbit：a comparison with corneal penetration．Curr Eye Res，1991，10∶571
(收稿：1999－06－21　修回：2000－01－18)

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