【摘要】 目的:分析糖尿病2型患者眼表及泪液蛋白成分与正常泪液的异同。方法:糖尿病2型患者46例92眼；正常对照39例(78眼)。观察指标包括角膜知觉、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色、Schirmer I试验及结膜印记细胞学检查，将糖尿病患者按病程DM≤5a，5a＜DM≤10a，DM＞10a分为3组并分别测定各组泪液总蛋白和泪液主要蛋白质含量，同时通过不连续的SDSPAGE蛋白电泳观察其形成的蛋白电泳条带，并与正常人的泪液对比。结果:糖尿病组分别与对照组比较，角膜知觉减退(Z=2.488, P<0.05)，Schirmer I测定值降低(t=3.854，P<0.05)，泪膜破裂时间缩短(t=7.212，P<0.05)，角膜荧光素染色阳性率增加(Z=2.161, P<0.05)，杯状细胞密度下降(t= 6.498，P<0.01)，结膜鳞状化生程度增加(Z=3.022，P<0.05)，泪液总蛋白两组间比较差异无显著性，但糖尿病组与对照组比较，乳铁蛋白、溶菌酶及分泌性免疫球蛋白IgA浓度降低。结论:糖尿病患者易发生眼表异常，泪液SDSPAGE有助于发现糖尿病患者泪液蛋白质的变化。
【关键词】 糖尿病 眼表 泪液蛋白
0引言
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种较常见的代谢异常疾病，可引起眼部的多种并发症，除DM视网膜病变、白内障等致盲性并发症外，目前的研究发现，干眼症及其他眼表疾病在糖尿病患者中也有较高的发病率[1]。本研究旨在通过检测DM患者与正常人的角膜知觉、基础泪液分泌量、泪膜破裂时间、角膜荧光素染色并采用结膜印迹细胞学检查及泪液蛋白的初步分析来了解糖尿病患者眼表及泪液蛋白的改变情况。
1对象和方法
1.1对象
200702/200709，根据1998年WHO糖尿病诊断标准（外周静脉血浆血糖浓度，空腹≥7.0mmol/L或服糖后2h≥11.1mmol/L），选择就诊于我院内分泌科的2型糖尿病患者46例，其中男27例，女19例，平均年龄（65.4±7.9）岁。 纳入标准：DM病史≥1a，GHbA1≥7.0%，近2mo内无急性结膜炎、急慢性角膜炎和青光眼，无角膜接触镜配戴史，无眼部激光或其他眼部手术操作史，无眼外伤病史，全身无其他影响泪液分泌的疾病(如甲状腺功能亢进)，0.5a内未使用阿托品、新斯的明、人工泪液等影响泪液分泌的药物，2wk内无感冒。干眼症状的判定采用美国干眼流行病学调查的干眼症状判断标准：眼干、有异物感、烧灼感，眼红，睫毛上有碎屑，晨起睁眼困难，规定其中一项或多项经常出现或一直持续即诊断为干眼[2]。同期就诊于我院眼科的同年龄段非糖尿病患者排除眼表疾病及眼部手术者39例作为对照组，其中男23例，女16例，平均年龄（63.5±8.8）岁。
1.2方法
1.2.1角膜知觉检查
所有患者在未做其他检查前，用棉丝触患者角膜下方瞳孔缘至角膜缘之间3次，检查时避开患者视线。判断记录标准：1)正常，3次均有明显的触感，同时有瞬目动作；2)减退，3次有1～2次仍有触感，但无瞬目动作；3)消失，3次均无触感，亦无瞬目动作。
1.2.2 Schirmer I试验
观察对象在眼部5g/L丁卡因表麻状态下，采用5mm×35mm滤纸条，一端反折轻置于下睑中外1／3结膜囊内，嘱患者轻轻闭眼，5min后取出滤纸条，从折叠处计算并记录滤纸的湿润长度(mm)。
1.2.3 BUT检查
滴10g/L荧光素钠2滴于下睑结膜囊内，眨眼数次后，嘱患者睁眼，用裂隙灯显微镜的钴蓝色弥散光(宽光带3mm)，从瞬目后睁眼时开始用秒表计时到泪膜出现第一个干斑的时间，即为BUT。重复测量3次，取平均值。
1.2.4角膜荧光素染色
记录方式是将角膜分为四个象限，每个象限根据染色程度和面积分为四个等级：0级一无染色；1级一散在点状染色；2级一密集点状染色；3级一片状染色。
1.2.5印迹细胞学检查方法
使用0.2μm孔径醋酸纤维素滤纸(购于上海苏豪智能系统有限公司)，切剪成约4mm×5mm大小，浸蒸馏水中3～4h，以消除滤纸表面活性，取出、晾干、高压消毒、备用。患者平卧于检查床上，5g/L的丁卡因点眼2次，开睑器开睑。滤纸吸去下穹隆部泪液，以小颞子夹取醋酸纤维滤纸，粗糙面向下置于角膜颞侧水平2mm外的球结膜上，用玻棒轻轻按压持续6s印取表层上皮细胞后，950mL/L酒精固定10min以上。标本采用PAS联合苏木素染色法（PAS染色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司），具体染色过程按照试剂盒说明书操作。标本脱水后置于载玻片上，自然干燥，采用二甲苯使其透明，置于普通光学显微镜下观察上皮细胞的连接，胞核、胞质的颜色，上皮细胞角化，杯状细胞数等，然后根据Nelson分级标准[3]将印迹细胞学的标本作0～3级分级。
1.2.6泪液的采集
采用毛细吸管法在DM患者及对照者下泪河采集约20μL非刺激性泪液，采集的泪液立即置于80℃冰箱中保存备用。
1.2.7泪液总蛋白的测定
采用Brandford法测定泪液总蛋白含量，以小牛血清白蛋白作为标准（Brandford蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所）。
1.2.8分泌性免疫球蛋白IgA的测定
采用放射免疫分析药盒（购于原子高科股份有限公司）测定。
1.2.9泪液SDSPAGE
取泪样5μL，加入2×SDS凝胶加样缓冲液稀释l0倍，在100℃加热3min使蛋白质变性。 每孔分别加入经处理后样品、低相对分子质量的标准蛋白质(Marker)、纯化溶菌酶溶液、纯化人血清白蛋白及纯化乳铁蛋白溶液（后三者质量浓度均为0.lg/L）,100V,电泳约2.5h。 考马斯亮蓝染色约40min，脱色液脱色3h后采用BioRad图像分析系统，对分离出的蛋白质条带作定性、定量分析。
统计学处理：所得数据采用SPSS11.5软件包进行统计学分析，角膜知觉检查、角膜荧光素染色、结膜鳞状化生级别的差异采用等级资料秩和检验，Schirmer I试验、BUT 检查、结膜杯状细胞密度差异以及泪液蛋白浓度采用IndependentSamples t Test及方差分析。
2结果
2.1两组干眼症状发生率的比较
DM患者干眼症状的发生率较对照组明显增高，经χ2 检验χ2=4.209,P=0.040,有显著性差异（表1）。
2.2角膜知觉检查结果
糖尿病组角膜知觉检查平均秩为91.89,对照组为77.96,经秩和检验得统计量U=3000.0,统计量W=6081.0,Z=2.488,P=0.013,有显著性差异（表2）。表2 DM组和对照组角膜知觉比较(略)
2.3 Schirmer I试验检查结果
糖尿病组的Schirmer I试验平均值为(9.17±3.51)mm，对照组的Schirmer I试验平均值为(11.40±4.01)mm，两组间差异有显著性(t=3.854，P=0.000)。
2.4 BUT检查结果
糖尿病组的泪膜破裂时间平均为(8.73±2.94)s，对照组的泪膜破裂时间平均为(12.38±3.67)s。两组间BUT值差异有显著性(t=7.212，P=0.000,表3)。表3 DM组和对照组角膜荧光素染色比较(略)
2.5角膜荧光素染色结果
糖尿病组角膜知觉检查平均秩为92.32,对照组为77.46,经秩和检验得统计量U=2961.0,统计量W=6042.0,Z=2.161,P=0.031,两组间有显著性差异。
2.6印迹细胞学检查结果DM组平均杯状细胞计数（73.01±42.04）个/mm2与对照组（113.82±39.30）个/mm2经t 检验比较，两组差异有统计学显著性意义(t= 6.498，P<0.01)。糖尿病组结膜鳞状化生级别平均秩为95.35,对照组结膜鳞状化生级别平均秩为73.88,经秩和检验得统计量U=2681.5,统计量W=5763.5,Z=3.022,P=0.003,有显著性差异。
2.7泪液总蛋白的测定结果
DM组及对照组泪液总蛋白含量分别为(13.71±5.6)g/L和（15.90±1.14）g/L，两组间比较，差异无显著性（t=1.693,P>0.05）。
2.8分泌性免疫球蛋白IgA的测定DM组及对照组泪液分泌性免疫球蛋白IgA含量分别为(2.02±5.6)g/L和（2.97±1.61）g/L，两组间比较，差异有显著性（t=2.084,P<0.05）。
2.9泪液SDSPAGE结果
电泳分离出的泪液主要蛋白质为：溶菌酶(lysozyme)、乳铁蛋白(lactoferrin)、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)及泪液特异前血清白蛋白(tear specific prealbumin，TSP)：BioRad图像处理系统测得各蛋白质浓度。
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